好塩性に着目したサーモライシンの構造と機能の蛋白質工学的解析と応用

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660082
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126)
• Keywords: プロテアーゼ / 蛋白質分解酵素 / 酵素活性 / 蛋白質工学 / 好塩性 / 酵素構造 / 金属酵素 / サーモライシン

Research Abstract

1.サーモライシンの好塩性に対するpH、温度、アルコール添加の効果:サーモライシン(TLN)の好塩性は4M NaCl存在下におけるペプチド加水分解活性とNaCl非存在下の活性の比(活性化度)により評価した。酵素活性はpH7に至適pHをもつベル型のpH依存性を示すが、活性化度もpH7に最大値をもつベル型を示した。活性化度はpH7で12、pH5.5で2、pH9で4であった。酸性側のpKaは[NaCl]の0Mから4Mへの増加につれて、5.4から6.6へ上昇したが、アルカリ性側のpKaは7.8のままであった。温度を5℃から37℃へ上昇させると、活性は3倍増大したが、活性化度は18倍から10倍へ減少した。一方、メタノールやエタノールなどのアルコールを添加すると活性が大きく低下し、10%メタノール存在下では活性は10%に低下した。しかし、活性化度もアルコール濃度の増加につれて低下し、10%メタノール存在下では12から4に低下した。TLNの等電点はpH5付近にあることから、TLN分子表面に正負を問わず電荷の数が多いほど、活性化度は大きいことが示された。温度が高いほど、またアルコール濃度が高いほど溶液の誘電率は低く、誘電率が低いほど活性化度が低いことが示された。
2.TLN分子表面の荷電状態及び活性部位残基の蛋白質工学的改変:化学装飾と部位特異的変異導入により、酵素表面の荷電状態を変化させる。リジンのトリニトロベンジル化、チロシンのニトロ化とアミノ化、アスパラギン酸とグルタミン酸のカルボキシル基のスクシニル化とマレイル化を試みた。チロシン残基を最大16残基までニトロ化した。活性はニトロ化の度合いに応じて低下したが、NaClにより引き起こされる活性化度もニトロ化に応じて低下した。ニトロチロシンを還元してアミノチロシンに変換すると、活性は2-3倍増加すると共に、活性化度も未修飾酵素のレベルにまで回復した。たとえば16残基のチロシンをニトロ化下ニトロ化酵素の活性化度は、活性測定のpHを5.5から8.5に変化させるにつれて、徐々に減少した。以上の結果からチロシンに負電荷を導入すればするほど活性も活性化度も低下することが示された。一方、アミノ基の正電荷を消去してもカルボキシル基の負電荷を消去しても、塩による活性化度は低下した。アミノ基の正電荷を無水マレイン酸により負電荷に変換しても活性化度は未修飾酵素と同程度であった。中性pHで正電荷と負電荷の総数が最も多いとき塩による活性化度が最も高いことから、酵素分子表面に正負を問わず電荷数が多いほど塩による活性化が増大することが示された。これは水和イオンと分子表面の相互作用が強いほど酵素活性が高くなることを意味しており、TLNの好塩性は酵素分子表面の荷電基とイオンとの相互作用に基づく可能性が高い。

Research Products

• [Publications] K.Inouye: "Need for aromatic residne at position 115 for proteolytic activity found by site-directed mutaqenesis of ....." Biosci.Biotech.Biochem.62・4(印刷中). (1998)
• [Publications] K.Inouye: "Effects of pH,tempetature,and alcohols on the remarkable activation of thermolysin by salts." J.Biochem.122・2. 358-364 (1997)
• [Publications] K.Inouye: "Effect of salts on the solubility of thermolysin:A remarkable increase in the solubility as ....." J.Biochem.123(印刷中). (1998)
• [Publications] S.B.Lee: "The states of tyrosyl residues in thermolysin as examined by nitration and pH-dependent ionization" J.Biochem.121・2. 231-237 (1997)
• [Publications] K.Morimoto: "Flow cytometric analysis of sialyl Lewis A antigen on human cancer cells by using ....." Cytotechnology. 24・3. 219-226 (1997)
• [Publications] K.Morimoto: "A sensitive enzyme immunoassay of human tyroid-stimulating hormone(TSH)by using ....." J.Immunol.Methods. 205・1. 81-90 (1997)
• [Publications] S.OHNAKA: "Deletion of the κ genes from the mouse hybridoma established with NS-l myelomas" Cytotechnology. 24・3. 213-218 (1997)
• [Publications] T.Takita: "Lysyl-tRNA synthetase from Bacillus stearo-thermophilus.Formation and isolation of ....." J.Biochem.121・2. 244-250 (1997)
• [Publications] T.Takita: "A new filter assay in the study of lysyl-tRNA synthetase from Bacillus stearethermo ....." Biosci.Biotech.Biochem.61・4. 726-728 (1997)
• [Publications] K.Inouye: "Bispecific-Ab-based immunoassay of thyroid-stimulating hormone" Cancer Immunol.Immunother.45・3/4. 159-161 (1997)
• [Publications] 井上 國世: "二特異性抗体" 日本農芸化学会誌. 71・10. 1049-1053 (1997)
• [Publications] 井上 國世: "生体化学物質の測定技術と今後の課題" 化学工業. 48・9. 703-708 (1997)
• [Publications] 井上 國世: "亜鉛メタロプロテイナーゼの活性を司どる残基" 化学と生物. 35・10. 723-724 (1997)
• [Publications] M.R.El-Gewely: "Biotechnology Annual Reuiew voL.3" Elsevier, 353 (1997)