好塩性に着目したサーモライシンの構造と機能の蛋白質工学的解析と応用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660082
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126)
• Keywords: サーモライシン / 金属プロテアーゼ / 酵素活性 / 蛋白質工学 / 化学修飾 / アスパルテーム / 塩 / プロテアーゼ

Research Abstract

サーモライシン(TLN)は好熱性の亜鉛プロテアーゼである。我々はTLNの活性が反応液中に添加した塩濃度の増大に応じて指数関数的に増大し、飽和濃度(5MNaCl)では数十倍にも達することを見いだした。TLNは好塩性酵素である。本研究では、TLNの好塩性がどのような構造的原理によりもたらされるかを、主として蛋白質工学により解明しようとした。TLNに好塩性を賦与する要因として、溶媒と酵素表面との相互作用の変化(環境因子)と酵素の構造変化(構造因子)を検討した。 環境因子の検討:塩による活性化はpHや温度に大きく依存した。NaClが存在しないときの活性に対する4MNaCl存在下の活性の比(活性化度)は中性pHで最大値をとるベル型を示し、pH5とpH10ではほとんど活性化が認められない。活性化は低温ほど顕著であり、高温ほど小さい。酵素表面のTyr残基のニトロ化とアミノ化の効果からTLNの好塩性は分子表面の電荷の変化に依存することが示された。一方、TLNの熱安定性も塩の存在下に増大することを見いだした。安定性は1-2MNaClで最大を示し、4MNaClでは塩が存在しない場合と同程度であった。1-2MNaClは変性の活性化エネルギーを2倍増大させた。塩の活性と安定性に対する効果は相互に独立した機構でもたらされるものと判断された。TLNの溶解度は可溶性蛋白質の中では著しく小さい(lmg/mL)。これはTLN分子表面が疎水性に富むことを示唆しているが、1-5Mの塩の添加により溶解度が20-70mg/mLにも増大することを見いだした。TLNの低溶解度は利用上の障害となっているが、塩の添加が、溶解度、活性、安定性を顕著に増大させることから、本酵素の利用に塩が重要な役割を果たすことが示された。構造因子の検討:TLNの活性部位に存在しS2サブサイトを構成するTrp115が、好塩性に関与するClイオンおよびBrイオンと直接相互作用することを、紫外部吸収差スペクトル法により見いだした。この相互作用がTLNに好塩性を賦与する可能性を検討した。部位特異的変異導入によりTrp115を種々のアミノ酸に変換したところ、芳香族アミノ酸に置換した場合のみ活性が残り、他のアミノ酸.(例:Leu,Val,Ile,Ala,Ser,Thr)では活性が認められなかった。115位の芳香族アミノ酸が活性に必須であることが示された。塩の存在下においてTLNの高次構造変化を、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、円偏光二色性(CD)により検討したところ、目立った変化は認められなかった。塩の橋加によりTLNは低活性型から高活性型へ移行すると考えられるが、このときの構造変化は微小である。270-290nmに芳香族のアミノ酸側鎖の状態変化を示す微小のCD変化が観察され、1-2MNaCl存在下に最大を示したことから、この構造変化は塩により生じる熱安定性の増大に対応している可能性が高い。TLNにより触媒される大豆蛋白質の消化とアスパルテーム前駆体(Z-Asp-Phe-OMe;ZAPM)の合成をNaClの存在下に検討した。ベプチドの加水分解とZAPM合成は4MNaClの存在下に飽和濃度の酵素を用いるとき60-120倍の活性増強を示したが、大豆蛋白質では、高濃度の塩により基質の凝集がおこり,活性増強は2-3倍にとどまった。

Research Products

• [Publications] K.Morimoto & K.Inouye: "Flow cytometric analysis of sialyl Lewis A antigen on human cancer cells by using F(ab')2μ fragments・・・" Cytotechnology. 24・3. 219-226 (1997)
• [Publications] S.Ohnaka,E.Soga,& K,Inouye: "Deletion of the K genes from the mouse hybridoma established with NS-1 myelomas." Cytotechnology. 24・3. 213-218 (1997)
• [Publications] K.Morimoto & K.Inouye: "A sensitive enzyme immunoassay of human thyroid-stimulating hormone(TSH)by using bispecitic・・" J.Immunol.Methods. 205・1. 81-90 (1997)
• [Publications] S.-B.Lee,K.Inouye,& B Tonomura: "The states of tyrosyl residues in thermolysin as examined by nitration and pM-dependent・・・" J.Biochem.121・2. 231-237 (1997)
• [Publications] T.Takita,K.Inouye,B.Tonomura,他6人: "Lysyl-t-RNA Syntherase from Bacillns stearo-thermophilus. Formation and isolation of・・・" J.Biochem.121・2. 244-250 (1997)
• [Publications] T.Takita,K.Inouye,B.Tonomura 他1人: "A new filter assay in the study of lysyl-tRNA syntherase from Bacillns stearothermophilus." Biosci.Biotechnol.Biochem.61・4. 726-728 (1997)
• [Publications] K.Inouye,S.-B.Lee,K.Nambu 他1人: "Effects of pH,temperature,and alcohols on the remarkable activation of thermolysin by salts." J.Biochem.122・2. 358-364 (1997)
• [Publications] 井上國世: "生体化学物質の測定技術と今後の課題" 化学工業. 48・9. 703-708 (1997)
• [Publications] 井上國世: "二特異性抗体" 日本農芸化学会誌. 71・10. 1049-1053 (1997)
• [Publications] K.Inouye: "Bispecific-Ab-based immunoassay of thyroid-stimulating hormone" Cancer Immunol.Immunother.45・31_4. 159-161 (1997)
• [Publications] 井上國世: "亜鉛メタロプロテイナーゼの活性を司どる残基-Matthews説とMock説" 化学と生物. 35・10. 723-724 (1997)
• [Publications] K.Inouye,N.Mazda & M.Kubo: "Need for aromatic residue ar position 115 for proteolytic actisity found by site-directed." Biosci.Biotechnol.Biochem.62・4. 798-800 (1998)
• [Publications] K.Inouye,S.-B.Lee,& B.Tonomura: "Effects of nitration and amination of tyrosyl residues in thermolysin on its hydrolytic・・・" J.Biochem.124・1. 72-78 (1998)
• [Publications] K.Inouye,K.Kuzuya & B.Tonomura: "Sodium chloride enhances markedly the thermal stability of thermolysin as well as・・・" Biochim.Biophys.Acta. 1388. 209-214 (1998)
• [Publications] K.Inouye,K.Kuzuya & B.Tonomura: "Effect of salts on the solubility of thermolysin a remarkable increase in the solubility・・・" J.Biochem.123・5. 847-852 (1998)
• [Publications] Y.Yamasaki,K.Uchida K.Inouye 他2人: "Separation of amino acids and peprides by high-performance hydrophobic・・・" J.Liquid chromatogr.Related Technol.(印刷中). (1999)
• [Publications] T.Sakaki,N.Sawada,K.Inouye 他2人: "Enzymatic properties of mouse 25-hydroxy vitamin 103 1α,hydroxylase expressed・・・" Eur.J.Biochem.259. 731-738 (1999)
• [Publications] 井上國世: "フェニルアラニンを仲介とするトリプトファンからジスルフィド結合へのエネルギー移動" 化学と生物. 36・7. 459-460 (1998)
• [Publications] T.Tokita,E.Akita,K.Inouye 他1人: "Lysyl-tRNA syntherase from Bacillus stearothermophilus,stopped-flow kinetic analysis・・・" J.Biochem.124・1. 45-50 (1998)
• [Publications] K.Inouye,M.Kurokawa,他2人: "Use of silk fibroin as a substratum for cultivation of animal cells" J.Biochem.Biophys.Methods. 37・3. 159-164 (1998)
• [Publications] K.Morimoto & K.Inouye: "Method for the preparation of bispecific F(ab')2μ fragments from mouse monoclonal・・・" J.Immunol.Mothods. (印刷中). (1999)
• [Publications] S.Jinno,T.Okita,& K.Inouye: "Total synthesis of an antioxidant isolated from yeast via palladium-catalyzed・・・" Bioorg.Med.Chem.Lett.(印刷中). (1999)
• [Publications] T.Sakaki,N.Sawada,K.Inouye 他2人: "Metabolic studies by using recombinant Escherichia coli cells producing rat mitochondrial CYP24." Eur.J.Biochem.(印刷中). (1999)
• [Publications] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology" M.Dekker,Inc., 1000 (1999)
• [Publications] 井上國世: "動物細胞工学ハンドブック" 朝倉書店, 300 (1999)