デハロゲナーゼによる有機ハロゲン物質分解機構に関する蛋白工学的構造研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660088
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 畑 安雄 京都大学, 化学研究所, 助教授 (10127277)
• Keywords: ハロ酸デハロゲナーゼ / X線結晶構造解析 / 脱ハロゲン化反応 / 反応中間体 / エステル中間体 / 反応機構

Research Abstract

地球環境汚染の原因となる有機ハロゲン化合物からハロゲンを加水分解的に脱離する脱ハロゲン化酵素の一種であるPseudomonas sp.YL由来L-2-ハロ酸デハロゲナーゼ(L-DEX YL)の反応過程で生成される複合体の立体構造決定を行った。通常は酵素反応が高速で進行し、これらの状態を結晶中に長時間トラップするのは困難である。そこで、Ser175をAlaに置換したS175A変異体を用いて反応中間体結晶を調製し、この結晶を分子間架橋を施した後に基質を含む沈殿剤溶液に漬けて複合体結晶を調製し、2Å程度の分解能でX線解析を行った。その結果、電子密度図にはAsp10側鎖のカルボキシル酵素に繋がった大きいピークとAlal75付近に小さいピークが現われた。大きいピークは、Asp10が基質のC2-炭素を求核攻撃し共有結合してできたエステル中間体の基質部分に相当する。この時、基質は、塩素が脱離してD-異性体になっている。また、小さいピークは、欠損したSerのヒドロキシル基近傍の空間に新たに入った水分子である。エステル中間体では、Asp10-Thr14の領域が活性部位の方へ移動し、求核残基Asp10の側鎖カルボキシル基が回転するようにコンホメーション変化して基質のC2-炭素を攻撃する。基質のカルボキシル基は、Ser118の側鎖ヒドロキシル基やAsn119の主鎖アミノ基との水素結合で安定化されている。基質のアルキル基は、Tyr14、Leu45、Phe60、Lys151やTrp179で構成される疎水チャネルに挿入され、疎水的相互作用で安定化されている。以上の結果、L-DEX YLは、エステル中間体を経由するSN2(二段階求核置換反応)で脱ハロゲン化反応を触媒することが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] 畑 安雄: "L-2-ハロ酸脱ハロゲン化酵素の立体構造と反応機構の解析" 日本結晶学会誌. 39巻・5号. 358-365 (1997)
• [Publications] Yong-Fu Li: "Crystal Structures of Reaction Intermediates of L-2-Haloacid Dehalogenase and Implications for the Reaction Mechanism" Journal of Biological Chemistry. 273巻. (1998)