ウシES様細胞をベクターとした外来遺伝子導入法の開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660305
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 岩崎 説雄 東京農業大学, 農学部, 教授 (50184867)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高田 達行 国立小児病院, 小児医療センター, 研究員 ; 長島 孝行 東京農業大学, 農学部, 講師 (20231483)
• Keywords: 胚性幹細胞 / ベクター / 遺伝子導入 / 凝集キメラ / エレクトロポレーション

Research Abstract

ウシES様細胞をベクターとして外来遺伝子導入を行うシステムの開発の開発を目的として、研究初年度の本年は、1.マウスES細胞と四倍体胚との凝集キメラの作出、2.ウシES様細胞と四倍体胚との凝集キメラの作出、3.レポーター遺伝子の調製、4.ウシ培養細胞への遺伝子導入と選別法の確立を行い、以下の結果を得た。
1.マウスES細胞と四倍体胚との凝集キメラの作出:マウス4倍体胚を作出するため、2細胞期胚を用いた最適電気融合条件を検討した。これとES細胞との凝集キメラを作出し、さらに偽妊娠雌マウスに移植し、キメラマウスの作出を行った。
2.ウシES様細胞と四倍体胚との凝集キメラの作出:ウシ4倍体胚を作出するため、体外受精により作出した2細胞期胚を電気刺激により細胞融合を行い、四倍体胚を作出した。その後、これとES様細胞との凝集キメラを作出し、さらにホルモン処理して発情を同期化した雌ウシに移植し、キメラウシの作出を行った。
3.レポーター遺伝子の調製:自家蛍光を発するGFPベクターのクローニング部位に、胚で発現が確認されているPGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)のプロモーター領域を連結し、レポーター遺伝子の構築を行った。
4.ウシ培養細胞へのGFP遺伝子導入と選別法の確立:エレクトロポレーションによる効率的遺伝子導入を行うため、DNA濃度とES細胞数、電圧、時間など種々の条件で遺伝子導入を行い、蛍光顕微鏡による観察により、自家蛍光を発する細胞のコロニーを得た。
以上の結果をもとに、次年度は遺伝子導入した細胞の凝集キメラの作出をめざす。