ウシES様細胞をベクターとした外来遺伝子導入法の開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09660305
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 岩崎 説雄 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (50184867)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高田 達之 滋賀医科大学, 助教授 ; 長島 孝行 東京農業大学, 農学部, 講師 (20231483)
• Keywords: 胚性幹細胞 / 凝集キメラ / 遺伝子導入 / エレクトロポレーション / ベクター

Research Abstract

ウシES様細胞または体細胞をベクターとして外来遺伝子導入を行うシステムの開発の開発を目的として、研究2年目の本年は、1)レポーター遺伝子の調製、2)ウシ体細胞への遺伝子導入、3)ウシ4倍体胚と遺伝子導入体細胞とのキメラ胚の作出、4)ウシキメラ胚での遺伝子発現の確認を行い、以下の成績を得た。
1) レポーター遺伝子の調製:自家蛍光を発するGFPベクターのクローニング部位に、胚で発現が確認されているPGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)のプロモーター領域を連結し、レポーター遺伝子の構築を行った。
2) ウシ体細胞への遺伝子導入:乳腺細胞および胎児繊維芽細胞にエレクトロポレーションまたはリポフェクタミシにより効率的遺伝子導入を行うため、DNA濃度と細胞数、電圧、時間など種々の条件で遺伝子導入を行い、蛍光顕微鏡による観察により、自家蛍光を発する細胞のコロニーを得た。
3) ウシ4倍体胚と遺伝子導入体細胞とのキメラ胚の作出:体外受精により作出した2細胞期胚を電気刺激により細胞融合を行い、四倍体胚を作出した。これとGH導入乳腺細胞および胎児繊維芽細胞との凝集キメラを作出した。
4) ウシキメラ胚での遺伝子発現の確認:3)の凝集キメラ胚が胚盤胞期に発生した時点で、蛍光実体顕微鏡によりGFPの発現部位を検討した結果、ICMでの発現が確認され、キメラの手法を用いた胚へのGFPの導入に成功した。

Research Products

• [Publications] S. IWASAKI, Y ITO, S. IWASAKI: "In-vitro development of aggregates of bovine, inner cell mass cells or bovine mammary cells and putative tetraploid embryos produced by electrofusion." Jourual of Reproduction and Development. 45・1印刷中. (1999)