細胞内チロシンリン酸化のリアルタイム画像化法の開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670115
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: 国立衛生試験所
• Principal Investigator: 川西 徹 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室長 (40124383)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡部 明子 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室員 (50291117) ; 内田 恵理子 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 主任研究官 (80176685)
• Keywords: 蛍光プローブ / 蛍光顕微鏡 / 画像解析 / チロシンリン酸化 / src-類似領域

Research Abstract

チロシンキナーゼ情報伝達系において、タンパク質がチロシンリン酸化をうけた後、細胞内の各種機能分子がリン酸化部位を認識してタンパク質に結合し、その結果機能分子が活性化をうけ、さらに情報が下流に伝わることが明らかとなっている。その際機能分子がリン酸化部位を認識するにあたっては、SH2領域あるいはSH3領域と呼ばれるこれら機能分子に共通した相同領域が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。したがってSH2領域を有する機能分子をプローブとして用いることにより、チロシンキナーゼ情報伝達系において重要な役割を果たすリン酸化部位を特異的に検出することが可能になるととも、さらに機能分子の動きを画像化することにより情報が下流に伝わる経路の解析にも利用できる可能性が生まれる。そこでSH2領域を有する機能タンパク質分子であるホスホリパーゼCγ(530-850)およびGRB2(1-217)のCy2およびCy3.5による標識を試みた。その結果、ホスホリパーゼCγについてはCy2およびCy3.5についてそれぞれ1分子あたり2.8分子および2.7分子が標識されていると概算された。一方GRB2についてはどちらも2.0分子標識されていると概算された。次に蛍光標識ホスホリパーゼCγをMDCK細胞にマイクロインジェクションし、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、多くの細胞で形質膜への分布が検出された。この細胞をEGF5μg/mlを30分処理してみたところ、細胞質への蛍光の核酸が観察され。今後GRB2との局在の違い、およびGFPで標識したタンパク質を発現させ、局在の違いを検討する予定である。

Research Products

• [Publications] Hikaru TANAKA: "Two Dimensional Millisecond Analysis of Intracellular Ca^<2+> Sparks in Cardiac Myocytes by Rapid Scanning Confocal Microscopy:Increase in Amplitude by Isoproterenol" Biochem.Biophys.Res.Commun. 233. 413-418 (1997)
• [Publications] 川西 徹: "細胞内カルシウムイオンのイメージング" 組織細胞工学. 24. 4-7 (1998)
• [Publications] Hikaru TANAKA: "Intrasarcomere[Ca^<2+>]Gradients and Their Spatio-Temporal Relation to Ca^<2+> Sparks in Rat Cardiomyocytes" J.Physiol.(in press). (1998)
• [Publications] Masayuki YAMAMOTO: "Discrepant intracellula pH changes following intracellula C^<2+> increases induced by glutamate and Ca^<2+> ionophores in rat hippocampal neurons" Life Sci.(in press). (1998)
• [Publications] 川西 徹: "イオンインジケータ" 病理と臨床. (in press). (1998)
• [Publications] 川西 徹: "共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた細胞内カルシウムイオンの高速高分解能画像化" 日本薬理学雑誌. (in press). (1998)