第2のFAK分子族チロシンキナーゼCAKβを活性化する上流シグナル伝達路の同定

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670137
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 佐々木 輝捷 札幌医科大学, 医学部・附属がん研究所, 教授 (00045494)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐々木 洋子 札幌医科大学, 医学部・附属がん研究所, 講師 (60045424)
• Keywords: CAKβ / PYK2 / タンパク質チロシンキナーゼ / cDNA発現クローニング / Hic-5 / SH2ドメイン / チロシンリン酸化 / 核移行

Research Abstract

1. CAKβ/PYK2に結合・会合するタンパク質を発現クローニングにより検索した。bait plasmidとしてpRTM116vectorのLexA DNA結合ドメインにin frameで組み込んだCAKβの断片を用い、酵母のtwo-hybrid系を用いて、ヒト脳cDNA libraIy(Clontech,HL4004AH)をスクリーニングし陽性クローンを得た。その中の1つは、約1600アミノ酸残基をコードするcDNAの断片であり、そのC末240残基にCAKβが結合した。2.CAKβ結合タンパク質として同定したHic-5のチロシンリン酸化は、COS-7細胞でCAKβの共発現により亢進し、そのレベルは細胞を高浸透圧で刺激すると増強した。Y60F変異Hic-5の発現では、Hic-5のチロシンリン酸化が認められなかったので、Hic-5のTyr-60残基がこのリン酸化の主要部位であることを見い出した。CAKβのHic-5 結合部位欠失変異体は、Hic-5をチロシンリン酸化することが出来ず、リン酸化には両者の結合が重要であった。リン酸化したHi-5はGST-CskSH2に結合したが、この結合は特異的で、Fyn、Src、Csk,のSH2ドメインには結合しなかった。3.野生型CAKβは細胞質に存在するが、A点変異を持つCAKβは核にのみ局在した。野生型CAKβも細胞をLeptomycin Bの存在下に培養すると、その一部が核に蓄積した。Hic-5は焦点接着に局在するタンパク質であるが、A点変異CAKβをHic-5と共に発現すると、Hic-5の一部は核内にも局在するようになった。

Research Products

• [Publications] Ohba,T.: "Dot far-western blot analysis of relative binding affinities of the Src homology 3 domains of Efs and its related proteins." Analytical Biochemistry. 262・2. 185-192 (1998)
• [Publications] Ohba,T.: "Interction of two Proline-rich sequences of cell adhesion kinase β with SH3 domains of p130^<Cas>-related proteins and GTPase-activating protein, Graf." Biochem.J.330・3. 1249-1254 (1998)
• [Publications] Matsuya,M.: "Cell adhesion kinase β forms a complex with a new member, Hic-5, of proteins localized at focal adhesions." J.Biol.Chem.273・2. 1003-1014 (1998)
• [Publications] Mitaka,T.: "Restricted expression of cell adhesion kinase-β in rat tissues." Amer.J.Pathol.150・1. 267-281 (1997)
• [Publications] Ueki,K.: "Integrin-mediated signal transduction in cells lacking focal adhesion kinase p125^<FAK>." FFBS Letters. 432・3. 197-201 (1998)
• [Publications] Ishino,M.: "Identification of an Efs isoform that lacks the SH3 domain and chromosomal mapping of human Efs." Oncogene. 15・14. 1741-1745 (1997)
• [Publications] Sasaki,H.et al.(分担): "Cell adhesion kinaseβ(CAKβ)forms a complex with new member, Hic-5, of proteins localized at focal adhesions. in “Cytoskeleton and G-proteins in reglation of Canser"edited by Noboru Kazumaki." Hokkaido University Medical Library Series, Vol.37, 184(3) (1998)