ロイコトリエン受容体のクローニングと細胞内情報伝達機構

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670147
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 和泉 孝志 東京大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (70232361)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 粂 和彦 東京大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (30251218) ; 清水 孝雄 東京大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (80127092)
• Keywords: LTB4受容体 / クローニング / LTD4受容体 / THP-1細胞 / 細胞内情報伝達

Research Abstract

プロスタグランジン(PG)、ロイコトリエン(LT)、血小板活性化因子(PAF)などの生理活性脂質は炎症、免疫、アレルギー反応の重要なメディエーターと考えられており、細胞膜に存在する特異的な受容体を介してその作用を発現する。種々のPG類の受容体やPAF受容体はすでにcDNAクローニングされ、分子生物学的な手法を用いた解析が進んでいる。しかしLT類の受容体のクローニングはなされておらず、その機能の解明は遅れていた。今年度の本研究では以下の研究実績をあげることができた。
1 LT受容体のcDNAクローニング
(1)OH-LTR(LTB_4受容体)のクローニング
HL-60細胞におけるOH-LTRの誘導現象を用いてDifferential Display法によるクローニングを試み、成功した。LTB_4受容体は7回膜貫通型の受容体であり、Gタンパク質に共役していた。CHO細胞に導入したところLTB_4対する非常に強いケモタキシスが観察された。現在、ゲノムDNAの解析、ノックアウトマウスの作成を行っている。
(2)Cys-LTR1(LTD_4受容体)のクローニング
モルモット肺およびTHP-1細胞より作成したcDNAライブラリーを用いて、COS-7細胞にタンパク質をMicro Plate(96well)上に一過性に発現させ、放射標識リガンドや細胞内カルシウム上昇反応を用いた発現クローニングを試みているところである。
2 LT受容体を介する細胞内情報伝達の解明
マクロファージ系の培養細胞(THP-1細胞)ではLTD_4刺激に対して細胞内カルシウムの上昇を認め、アラキドン酸の放出を認めた。細胞内情報伝達系の鍵を担う分子の一つであるMAPKの活性化機構を検討し、PKCα-Raf-1依存性の経路の存在を証明した。

Research Products

• [Publications] M.Hoshino: "Leukotriene D4 activates mitogen-activated protein kinase through a protein kinase Cα-Raf-1-dependent pathway in human monocytic leukemia THP-1 cells." J.Biol.Chem.273. 4878-4882 (1998)
• [Publications] I.Ishii: "Alanine exchanges of polar amino acids in the transmembrane domains of a platelet-activating factor receptor generate both constitutively active and inactive mutants." J.Biol.Chem.272. 7846-7854 (1997)
• [Publications] S.Ishii: "Cloning and characterization of a platelet-activating factor receptor gene." Adv.Exp.Med.Biol.407. 347-355 (1997)
• [Publications] T.Yokomizo: "cDNA cloning and mutagenesis study of leukotriene B_4 12-hydroxydehydrogenase." Adv.Exp.Med.Biol.407. 151-156 (1997)
• [Publications] T.Yokomizo: "A G-protein coupled receptor for leukotriene B_4 that mediates chemotaxis." Nature. 387. 620-624 (1997)