電顕的in situハイブリダイゼーションによるウイルス核酸同定法の確立

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670240
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 後藤 俊幸 大阪医科大学, 医学部, 講師 (30121651)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森田 智津子 大阪医科大学, 医学部, 助手 (50131355)
• Keywords: in situハイブリダイゼーション / ウイルス核酸 / 電子顕微鏡 / コントラスト増強 / PCR / EBウイルス / HIV

Research Abstract

最近PCRの進歩により遺伝子のレベルで新しいウイルスが解明され、その構成蛋白質やそのウイルスの性状が推察されるようになった。しかし、ウイルス遺伝子構造のみが知られているが,そのウイルス構造が確認できていないウイルスがある。ウイルス粒子の形態構造を知ることは、そのウイルス粒子の基本的な性状ばかりか、分類的位置関係、さらにその感染様式などの予測に重要である。そこで、これらのウイルスの形態を明らかにする手段として電顕的in situハイブリダイゼーションによるウイルス核酸同定法の確立することを目的とし、初年度の9年度は次の3項目について行った。
1.電顕的in situハイブリダイゼーションを確立するため、Epstein-Barrウイルス感染細胞中のEBV-DNAの存在をEBV BamHI-Wをプローブとして用い、低温樹脂包理切片上でのin situハイブリダイゼーションの条件および電顕的検出法を確立し、感染細胞内ウイルス前駆体の存在を明らかにした。
2.低温樹脂包理切片は免疫電顕法には優れているが、コントラストの良い像が得られないため、ウイルス粒子などの微細な構造の観察には十分ではなかった。そこでコントラスト増強のため、ルテニウムレッドとOsO_4混合液で免疫反応後に染色すると、高コントラストの像を得ることができ、免疫反応したウイルス粒子内部の構造を明らかにすることができた。
3.1コピーまたは数コピーの遺伝子でも検出できる電顕的in situハイブリダイゼーションを確立するため、HIV感染U1細胞(2コピー/細胞)を用いて、PCR法で増幅を行い、in situハイブリダイゼーションの最適条件を検討した。

Research Products

• [Publications] Goto T, Kohno T, ら: "Detection of Epstein-Barr Virus DNA in virus-infected cells by electron microscopic in situ hybridization." J Electron Microsc. 46・5. 431-437 (1997)
• [Publications] 中井益代、後藤俊幸: "HIVの形態構造" 臨床電顕誌. 30・2. 5-16 (1997)
• [Publications] Kawano Y, Tanaka Y, ら: "Mutational analysis of HIV-1 accessory genes:Requirement of site in nef gene for HIV-1 replication in activated CD4_+T cells in vitro and vivo." J.Virol. 71・11. 8456-8466 (1997)
• [Publications] Kohno T, Fujioka Y, Goto T, ら: "Contrast-enhancement for the image of human immunodeficiency virus from ultrathin section in immunoelectron microscopy." J.Virol.Method.(in press).