電顕的in situハイブリダイゼーションによるウイルス核酸同定法の確立

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670240
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 後藤 俊幸 大阪医科大学, 医学部, 講師 (30121651)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森田 智律子 大阪医科大学, 医学部, 助手 (50131355)
• Keywords: in situハイブリダイゼーション / ウイルス核酸 / 電子顕微鏡 / コントラスト増強 / PCR / アデノウイルス / HIV / ボルナ病ウイルス

Research Abstract

最近分子生物学の進歩により遺伝子のレベルで新しいウイルスが解明され、その構成蛋白質やそのウイルスの性状が推察されるようになったが、構造が確認できていないウイルスがある。ウイルス粒子の形態構造を知ることは、そのウイルス粒子の基本的な性状ばかりか、分類的位置関係、さらにその感染様式などの予測に重要である。そこで、形態未知のウイルスを明らかにする手段として電顕的in situハイブリダイゼーションによるウイルス核酸同定法を確立することを目的とした。2年度(最終年度)の10年度は新たに次の項目について行った。
1. アデノウイルス感染細胞内のウイルス粒子の結晶様配列は、低温樹脂包埋切片上でのin situハイブリダイゼーションの基本的条件および検出法を確立するのに、有用な試料であることがわかった。
2. PCR装置を用いて、プローブをhigh priming法で作製することにより、アデノウイルス感染細胞で1コピーまたは数コピーの遺伝子でも検出できる電顕的in situハイブリダイゼーションが確立できた。また、HIVでも検出率が向上した。
3. 免疫反応用の低温樹脂包埋切片に、ルテニウムレッドとOsO_4混合液でコントラスト増強のため方法は、核酸変性の高温処理過程を含むにもかかわらず、in situハイブリダイゼーションでも利用できることがわかった。
4. 遺伝子配列が既知で、形態が確立していないボルナ病ウイルスの形態および形態形成を免疫電顕で明らかにした。さらに、今回確立されたin situハイブリダイゼーションで、このウイルスに最適なプローブを開発し、遺伝子的にも明らかにしようとしている。

Research Products

• [Publications] 後藤俊幸、森松伸一ら: "エイズウイルスの増殖過程とその阻害" 電子顕微鏡. 32(補2). 173-175 (1997)
• [Publications] Goto T, Nakai M, Ikuta K: "The life cycle of human immunodeficiency virus type 1" Micron. 29(2/3). 123-138 (1998)
• [Publications] Kohno T, Fujioka Y, Goto T ら: "Contrast-enhancement for the image of human immunodeficiency virus from ultrathin section in immunoelectron microscopy." J.Virol.Method. 72. 137-143 (1998)
• [Publications] Kohno T, Goto T ら: "Fine structure and morphogenesis of Borna disease virus." J.Virol.73(1). 760-766 (1999)