1997 Fiscal Year Annual Research Report
プロテアーゼ活性を持つOprDポーリンの分子構造とOprDと相同なポーリンの発見
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09670299
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
良原 栄策 東海大学, 医学部, 助教授 (70167063)
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| Keywords | 緑膿菌 / 外膜 / ポーリン / OprD / プロテアーゼ / 触媒基 / 部位特異的変異導入 / OprE3 |
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| Research Abstract |
日和見感染症の主要起因菌である緑膿菌は抗生剤に高度多剤耐性を示す。この要因の一つは緑膿菌外膜にあるポーリンの孔サイズが小さいことに由来する。緑膿菌のOprDタンパクはポーリンであることを明らかにしてきた。更に我々はOprDはプロテアーゼ活性も併せ持つという興味深い発見をした。そこで本年度は以下の実験を行い成果を得た。(1)セリンプロテアーゼとOprDのアミノ酸配列を比較した結果、OprDプロテアーゼの触媒基はHis156,Asp208,Ser296であることが推定できた。そこでこれらアミノ酸が実際に触媒基として機能しているかを明らかにするため、これらアミノ酸を特異的に置換した変異タンパクの作製を試み、His156,Asp208,Ser296のアミノ酸をそれぞれGln,Asn,Alaに置換した三種類の変異タンパクの作製に成功した。次に変異タンパクのプロテアーゼ活性を測定した結果、その活性は全て野生型OprDの0.1%以下にまで減少しているのがわかった。これはこれら三つのアミノ酸残基がOprDプロテアーゼの触媒基であることを明瞭に示している。このようにしてOprDプロテアーゼの触媒基を同定することができた。(2)これら変異タンパクを発現している緑膿菌の薬剤感受性を調べた結果、薬剤感受性には何らの変化も見られなかった。これはこれら三種類のアミノ酸の置換はチャンネル活性に何ら影響しないことを示している。(3)OprDポーリンと相同性をもつOprE3タンパクを精製し、リポソームに再構成してチャンネル活性を調べた。その結果、OprE3はポーリン活性を有しその孔サイズは他のポーリンと同程度であることが明らかとなった。さらに平面脂質二重膜法を用いて調べたところ、OprE3はやはりチャンネルを形成しているということが確かめられた。現在OprE3遺伝子のクローニングを進めている。
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