ウエルシュ菌α毒素の生体膜破壊機構の分子生物学的解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670305
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokushima Bunri University
• Principal Investigator: 櫻井 純 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (80029800)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 敬子 徳島文理大学, 薬学部, 助手 (90170315) ; 越智 定幸 徳島文理大学, 薬学部, 助手 (80268705)
• Keywords: ウエルシュ菌 / α毒素 / 細菌内情報伝達系 / ホスフォリパーゼD / 低分子量Gタンパク質 / Rho / ARF / Rho-GDI

Research Abstract

ウエルシュ菌のα毒素によるウサギ赤血球膜中のリン脂質代謝系の活性化と溶血の間に密接な関係が存在すること、そして、この活性化に関与するホスフォリパーゼD(PLD)と低分子量Gタンパク質の間にも関係があることを明らかにしてきた。そこで、他の細胞のPLD活性化と低分子量Gタンパク質の関係から、PLDとRhoあるいはARFの関係に焦点を絞り検討した。まず、RhoとRho-GDIの遺伝子をウサギ網状赤血球のmRNAからcDNAとして単離した。いずれの遺伝子も、ヒト由来の遺伝子とほとんど同じであることが判明した。次に、単離された遺伝子をグルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子につないで大腸菌にトランスフォーム後、・その大腸菌から融合タンパク質の形で精製を試みた。その結果、Rhoに相当するタンパク質は、融合タンパクからトロンビンで切断時に分解され単離されなかったが、Rho-GDIに相当するタンパク質は単離され、このタンパク質は、抗Rho-GDI抗体を用いたウエスタンプロットで確認されたことから、-Rho-GDIと確認した。ARFの遺伝子も酵母から単離し、常法に従いARFをGSTフ-ジョンタンパクとして発現させ精製した。
黄色ブドウ球菌由来のEDIN、そして、ボツリヌスC2酵素でウサギ赤血球溶解物を処理すると、SDS-PAGEにおいて約42kDaのタンパク質がADPリボシル化されるのに、毒素のホスファチジン酸合成亢進作用は阻害されなかったが、Rhoの作用を阻害するRho-GDIは、用量に依存してα毒素の作用を阻害した。一方、ARFは、この作用を阻害しなかった。従って、α毒素によって活性化されるリン脂質代謝系はRhoによるPLDの活性化が重要であると推察される。一方、ARFは関与していないと推察される

Research Products

• [Publications] M.Nagahama, T.nakayama, K.Michiue and J.Sakurai: "Site-Specific Mutagenesis Clostridium perfringeus Alpha-Toxin. Replacement of Asp-56, Asp-130, or Glu-152 causes loss of Enzymatic and Hemolytic Activities" Infection and Immunity. 65. 3489-3492 (1997)
• [Publications] J.Sakurai, M.Nagahama, and J.Sakurai: "Major toxins of Clostrictuim perfringens" J.Toxicol.-Toxin Reviews. 16. 195-214 (1997)
• [Publications] 櫻井 純: "細菌性食中毒講座(6)Gram陽性菌桿菌4.Clostridium perfringens" J.Antibact. Antifung. Agents. 25. 651-657 (1997)