C型肝炎ウイルス感染性RNAを用いたウイルス増殖系の開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670323
• Research Institution: National Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 杉山 和夫 国立がんセンター, 研究所ウイルス部, 研究員 (10242520)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 宣之 , 室長 (40150883)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / 感染性クローン / 培養細胞 / long RTPCR

Research Abstract

これまで報告してきた感染系における接種血清のHCV分子種は著しいquasi-speciesを呈していたが、KTLV-1感染T細胞(MT-2C細胞)に感染後、特定の分子種のみが増えてくることを見いだした。このような特定のクローンだけを増幅させるためにHCV感染8日目の細胞よりRNAを抽出し、HCVの構造領域および非構造領域に対してそれぞれlong RT PCRで増幅する事に成功した。これら二つのfragmentをプラスミドpBR322へ同時に導入することによってプラスミドのライブラリーを作製した。得られた196クローンのうち適切な長さと量のRNAが合成できたのは60クローンであった。3から5クローンを1セットにして、MT-2C細胞にRNAtransfectionを行った。trasnsfection後7、14日の上清からHCV RNAが検出されたものは3セットであった。さらに、そのセットのなかの個別のクローンについて同様のこと行ったところ、5クローンが陽性であった。最終的にcell free transmissionによって感染性クローンの可能性を持つものが3クローン得られたが、HCV産生能は弱いと考えられた。
次に、より強い感染性を示すクローンを得るために、上述3クローンからconsensusなアミノ酸配列を持つクローンを再構築した。このクローンにおいてHCV蛋白の合成が正しく行われることを確認するために、CMV promoterのもと、COS-1細胞で発現させcorc,envelopc2,NS3,NS4A, NS5A蛋白の発現を調べた。その結果、今回初めてHCV感染培養細胞由来のクローンよりこれらの蛋白発現が確認された。
以上のことより感染性クローンとして必要な条件が確認できたので今後このクローンを用いてより強い感染性を確認し、培養細胞を用いたHCV感染増殖系を確立する予定である。

Research Products

• [Publications] K.Sugiyama: "Genetic analysis of the hepatitis C virus(HCV)genome from HCV-infected human T cells." Journal General Virology. 78. 329-336 (1997)
• [Publications] M.Ikeda: "Heaptitis G virus replication in human cultured cells displaying susceptibility to hepatitis C virus" Biochem.Biophys.Res.Commun.235. 505-508 (1997)
• [Publications] M.Ikeda: "Analysis of the cell tropism of HCV by using in vitro HCV-infected human lymphocytes and hepatocytes." Journal of Hepatology. 27. 445-454 (1997)
• [Publications] K.Sugiyama: "Hepatitis C virus in pelvic lymph nodes and female reproductive organs." Japanese Journal of Cancer Research.88. 925-927 (1997)
• [Publications] N.Kato: "Hepatitis C virus population dynamics in human lymphocytes and hepatocytes infected in vitro." Journal of General Virology. 79. 1859-1869 (1998)