1997 Fiscal Year Annual Research Report
シグナル伝達分子α4の遺伝子ターゲティングによる機能解析
| Project/Area Number |
09670339
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Research Institution | Kumamoto University |
|---|
Principal Investigator |
乾 誠治 熊本大学, 医学部, 助教授 (70243384)
|
|---|
| Keywords | リンパ細胞 / シグナル伝達 / 遺伝子ターゲティング / 抗原レセプター |
|---|
| Research Abstract |
本年度の研究ではまずB細胞下流のシグナル伝達分子としてクローニングしたマウスα4cDNAをプローブとしてヒトα4分子をコードするcDNAをクローニングした。その結果ヒトα4とマウスα4はアミノ酸配列で83%同一で93%保存されていることを明かとした。ヒトα4cDNAの配列に基づいてゲノム遺伝子の一部をクローニングしFISH法によってヒトα4遺伝子がX染色体上に存在することを明らかとした。これらの結果はα4分子が細胞の重要な機能を司る分子であることを示唆する。
次にマウスゲノム遺伝子をクローニングしてすべてのエクソン・イントロン境界をDNAシークエンス法により明らかとし、プライマー伸長法により転写開始点を決定しα4遺伝子には4ヶ所の転写開始点が存在することを示した。5′上流2kbのDNA配列を決定しルシフェラーゼアッセイ法によりα4遺伝子のプロモーター領域が転写開始点の上流263bまでに存在することを明らかとした。
本研究ではα4分子の生体内での機能を明らかにする目的でCre/loxPシステムを用いたコンディショナル遺伝子ターゲティングを行っている。上記のマウスゲノム遺伝子の情報に基づいてES細胞に導入するターゲティングベクターを、PCR法及びサザンブロット法でスクリーニングするベクターの2種類作製した。翻訳開始点を含むエクソン1とエクソン2の両側にloxP配列を導入し、3′側のloxP配列の下流にネオマイシン耐性遺伝子と更にその下流に3個目のloxP配列を導入し相同組み替え体を選別するマーカーとしてDTA配列も導入した。3′の相同領域はPCRでスクリーニングするベクターでは約600bp、サザンブロット法でスクリーニングするベクターでは約4kbpとした。今後これらのベクターをES細胞にエレクトロポレーション法で導入し相同組み替え体を得て遺伝子ターゲティングを行っていく。
|
-
[Publications] Onda M.: "Expression and chromosomal localization of the human α4 gene whose structure is closely related to the yeast TAP42 protein of rapamycin-sensitive signal transduction pathway." Genomics. 46. 373-378 (1997)
-
[Publications] Baba M.: "Mouse germinal center B cells with the xid mutation retain resposiveness to anti-mouse CD40 antibodies but diminish IL-5 responsiveness." International Immunology. 9. 1463-1473 (1997)
-
[Publications] Inui S.: "Introduction of human CD40 gene with immunoglobulin enhancer and promoter creates mice with a population of human CD40^+ early B lineage cells in the bone marrow." Transgenics. (in press). (1998)
-
[Publications] Maeda K.: "The gene structure and promoter analysis of mouse lymphocyte signal transduction molecule α4 that is involved in a rapamycin-sensitive pathway." Gene. (in press). (1998)
