1997 Fiscal Year Annual Research Report
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09670529
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
田中 栄司 信州大学, 医学部, 講師 (50163506)
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| Keywords | in-situ hybridization / 肝組織 / HGV / HGV RNA / 一本鎖RNAプローブ / ジゴキシゲニン |
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| Research Abstract |
in-situ hybridizationの条件設定
1.肝組織切片の処理
パラフィン包埋肝組織切片を使用した。HGVのcDNA (nt.no.6904-7059)をpGEM-Tにクローニング後、転写反応によりDIGラベルの一本鎖RNAプローブを作成した。肝組織切片は脱パラ後、PBSで3回洗浄し、0.19NHCIで室温10分処理して内因性のalkaline phosphataseを不活化した。proteinase K (20mg/ml in PBS)で37℃20分処理後、4% paraformaldehyde in PBSで室温5分再固定した。0.2% glysine in PBSで洗浄し、0.1M TAE-HCI緩衝液で平衡化した。最後に、0.25% acetic anhydrideでアセチル化し、エタノールとクロロホルムで脱水した。
2.in-situ hybridization
hybridizationは報告された方法により行った。すなわち、前処理した組織切片をrehybridization (50% from amide,2XSCC)を45℃1時間行った後、hybridization液(50% formamide,10% dextran sulfate,1X Denhardt's solution,600mM NaCI,0.25% SDS,250 μg/ml of E coli tRNA, 10mM DTT,3.0μg/ml of DIG labeled RNA probe)を80μl乗せ、50%ホルマリンで飽和した湿箱で45℃16時間反応させた。hybridization後、組織切片を50% formamide in 2XSCCで45℃1時間インキュベートし、RNAseA (10μg/ml)で37℃30分処理し余分なプローブを取り除いた。2XSCCと1XSCCで2回、45℃1時間づつインキュベートし、最後にmalate緩衝液で洗浄した。hybridizationしたプローブの検出はDIG検出キット(Boehringer Mannheim社)により行った。
成績
上記条件で、肝組織切片中にHGV(G型肝炎ウィルス)RNAを特異的に検出可能であった。
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[Publications] Eiji Tanaka, et al.: "Hepatitis G virus/GB virus C infection in patients with chronic non-B,non-C hepatitis" Intern.Hepatol.Commun.6. 137-143 (1997)
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[Publications] Masakazu Kobayashi, et al.: "Antibody response to E2/NS1 hepatitis C virus protein in patients with acute hepatitis C" J Gastroenterol Hepatol. 12. 73-76 (1997)
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[Publications] Michael Tacke, et al.: "Humoral immune response to the E2 protein of hepatitis G virus is associated with long-term recovery from infection and reveals a high frequency of hepatitis G virus exposure among healthy blood donors" Hepatology. 26. 1626-1633 (1997)
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[Publications] 田中栄司: "非B非C型慢性肝疾患におけるHGBV-C/HGVの感染" 日本臨牀. 55. 49-53 (1997)
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[Publications] Eiji Tanaka, et al.: "Past and present hepatitis G virus infection in areas where hepatitis C is highly endemic and those where it is not endemic" J Clin Microbiol. 36. 110-114 (1998)
