筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角に蓄積するヘパラン硫酸様物質の精製および同定

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670637
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 加藤 丈夫 山形大学, 医学部, 教授 (90194828)
• Keywords: 筋萎縮性側索硬化症 / HepSS-1 / 脊髄 / スフェロイド / ヘパラン硫酸 / プロテオグリカン / IDPN / 運動ニューロン疾患

Research Abstract

HepSS-1により認識されるヘパラン硫酸プロテオグリカンを精製するため、IDPNを投与しスフェロイドを形成させたWistarラット30匹の脊髄をトリス塩酸緩衝液を用いてホモジネートし超遠心した。この沈査を8M尿素溶液でホモジネートし、8M尿素可溶性画分を回収した。この画分をSDS-PAGEし、Western blotにて検討した結果、HepSS-1に認識される約14.4kDaの細いバンドと、60〜100kDaの間に2本の太いバンドが認められた。2本の太いバンドはHepSS-1を反応させなくてもバンドが出現したので、非特異的なバンドと判断した。それに対して、14.4kDaバンドはHepSS-1の除去により完全にバンドは消失したので、HepSS-1が認識する特異的バンドと判断した。同様に、低分子ニューロフィラメント・トリプレットを認識する抗体で検討した結果、14.4kDaバンドとは異なった位置に陽性バンドが出現した。従って、Hepss-1が認識する物質はニューロフィラメントではないと判断した。
上記の8M尿素可溶性画分をゲル濾過クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを行って検討したが、クロマトグラフィーの各種条件設定が困難であったため、2次元電気泳動にて精製する方向に切り換えた。
この間、ヒト脊髄凍結組織が入手できたので、IDPN投与ラットと同様の検索を行い、同様の結果を得た。従って、現在、ヒト脊髄(正常及びALS症例)を用いて2次元電気泳動により精製を行っている。