ミトコンドリア病におけるチトクロームCによるアポトーシス誘導に関する研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670661
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 箕田 修治 熊本大学, 医学部付属病院, 講師 (30231616)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内野 誠 熊本大学, 医学部付属病院, 教授 (20117336)
• Keywords: ミトコンドリア脳筋症 / 変異ミトコンドリアDNA / 筋病理学的特徴 / チトクロームC / アポトーシス / DNA断片化

Research Abstract

本研究の目的はミトコンドリア(mt)DNAの変異によって生じるmt病の神経・筋変性においてcytochrome c(Cyt-C)によるアポトーシス誘導の関与を明らかにすることであり、このためには以下の実験を行なった。また、MERRFのmRNA変異と筋病理学的特徴の関連を報告した。
1.ヒト末梢血単核球(PBMC)およびマウス培養筋細胞におけるCyt-Cによるアポトーシス誘導の可能性の検討
健常成人PBMCおよびマウス培養筋細胞を用いて種々の濃度のCyt-Cを添加培養し、経時的にアポトーシスの有無を形態学的に観察し、DNAの断片化の有無を検討した。negative controlには薬剤無添加を、positive controlとしてactynomicin D(ACD)添加したものを用いた。ACD添加郡では数時間後よりアポトーシスを起こしたが、薬剤無添加およびCyt-C添加では、72時間の観察期間にアポトーシスを認めなかった。各細胞よりDNAを抽出後、DNA断片化の有無をアガロースゲル電気泳動法により観察したが、薬剤無添加およびCyt-C添加ではDNA断片化を認めなかった。
以上の結果からはCyt-C添加によるアポトーシスは形態学的には明らかでなかったが、これはアポトーシス過程の誘導→決定→実行段階の実行という最終段階をみたものであり、決定に至る過程でのアポトーシス関連蛋白の変化を観察する必要がある。このために、アポトーシス関連蛋白の各種抗体、RT-PCRのためのprimerを作成し、半定量的な評価が出来るようにシステムをセットアップ中である。
2.MERRFのmtDNA変異と筋病理特徴との関連をsingel fiber PCR法、in situ hybridization法を用いて明らかにした。これまでの報告と合わせmt脳筋症の3大症候群(OPEO,MELAS,MERRF)の筋病理の特徴と変異mDNAとの関連を明らかにしたことになる。

Research Products

• [Publications] Mita S et al.: "Singel muscle fiber analysis fo myoclonus epilepsy with ragged-red fibers (MERRF)" Muscle Nerve. (in press). (1998)
• [Publications] 徳永 誠 他: "変異ミトコンドリアDNAのsingle-fiber PCR法" 日本臨床. 第55巻12号. 207-210 (1997)