アデノウイルスベクターを用いたセルロプラスミン欠損症の治療に関する基礎的研究

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670686
• Research Institution: National Institute of Neuroscience, NCNP
• Principal Investigator: 武田 伸一 国立精神・神経センター, 神経研究所遺伝子工学研究部, 室長 (90171644)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 寛二 国立精神, 神経センター・神経研究所遺伝子工学研究部, 流動研究員 ; 宮越 友子 国立精神, 神経センター・神経研究所遺伝子工学研究部, COE研究員
• Keywords: セルロプラスミン欠損症 / セルロプラスミン / 神経細胞死 / 活性化酵素 / 遺伝子治療 / アデノウイルスベクター / ノックアウトマウス / 鉄沈着

Research Abstract

我々は、先に常染色体劣性の遺伝形式と中年以降にWilson病に類似した不随意運動、肝硬変、糖尿病の症候を呈し、血清のセルロプラスミンの著減する原発性セルロプラスミン欠損症の家系について、セルロプラスミン遺伝子のpoint mutationを明らかにした。この家系では、スプライシングの異常を介して、premature stop codonを生じ、C端の欠損したセルロプラスミンが翻訳されるが、銅結合部位を欠くために肝臓内で速やかに崩壊すると考えられた。セルロプラスミンのフェロオキシデースとしての活性が欠如するために2価の鉄が3価の鉄に酸化されず、組織鉄としてのフェリチンの基底核、肝、膵を中心とした沈着が観察される。一方では、比較的大型の神経細胞の変性と脱落が認められるが、その背景として、鉄沈着による障害の他にセルロプラスミンが活性化酸素の除去機構に関与しているために、活性化酸素による組織障害として、神経細胞の細胞死を招いている可能性がある。そこで、本研究では、セルロプラスミン欠損によるヘモジデローシスに対する遺伝子治療を将来の目標として、プラスミン遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込んで、肝細胞系及び非肝細胞系の培養細胞に感染させ、セルロプラスミンが蛋白として安定して発現するかどうか検討した。最初に、既に発表されている塩基配列を基に、RT-PCR法を用いて、マウス・セルロプラスミン遺伝子を全長(3.7kb)をクローニングした。次に、斎藤らにより確立されたCOS-TPC法に基づいて、セルプラスミン遺伝子がCAGプロモーターの制御下に発現するように組み換えたアデノウイルスを得た。続いて、内因性のセルロプラスミンの発現が低い線維芽細胞株10Tl/2、COS及び筋芽細胞株C2に感染させ、予想されたサイズのセルロプラスミンが発現していることを、Western blotを用いて確認した。一方で、我々はセルプラスミン遺伝子のノックアウトマウスを作製中であり、既に複数の系統のへテロマウスを得て、現在、ヘテロマウス同士の交配を行っている。そこで、ホモマウスの肝臓に対するin vivo遺伝子導入並びに、既に我々が大脳皮質から確立している方法でAstrocyteのprimary cultureを行い、in vitro遺伝子導入を行うことで、セルロプラスミンの発現と機能について、詳細に解析する予定にしている。

Research Products

• [Publications] Yuasa K et al.: "Effective restoration of dystrophin-associated proteins…" FEBS Letters. 425. 329-336 (1998)
• [Publications] Yoshida K et al.: "Insertional mutation by transposable…" Hum Mol Genet. 7. 1129-1132 (1998)
• [Publications] Hagiwara Y et al.: "Fiber-type-dependent expression of…" Acta Neuropathol(Berlin). 96. 228-232 (1998)
• [Publications] Kameya S et al.: "alpha 1 syntrophin gene disruption results…" J Biol Chem. 274. 2193-2200 (1999)
• [Publications] Ishii A et al.: "Effective adenovirus-mediated gene expression…" Muscle Nerve. (in press). (1999)
• [Publications] Nakamura A,et al.: "A novel Sac IRFLP in the 3'untranslated…" J Hum Genetics. (in press). (1999)
• [Publications] 武田伸一(分担執筆): "筋ジフトロフィーはここまでわかった Part2" 医学書院, 331(205-216) (1999)