1998 Fiscal Year Annual Research Report
葉酸受容体の組織特異的遺伝子発現に関与する転写因子の同定とcDNAクローニング
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09670793
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
犀川 太 金沢大学, 医学部・附属病院, 講師 (60283107)
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| Keywords | 葉酸受容体 / 組織特異的遺伝子発現 / 薬剤耐性 / 転写因子 |
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| Research Abstract |
1. 葉酸受容体(FR)遺伝子調節領域特異的結合因子の結合部位の同定:(1)非放射性ジゴキシゲニン標識プローブを用いたゲルシフト法により結合部位の同定をおこなった.FR遺伝子Exonl上流-352/-461の塩基配列内(109bp)に特異的に結合する核内蛋白の存在を,FR高発現細胞株であるKB細胞の核抽出蛋白を用いて明らかにした.(2)次に-352/-461断片での結合塩基配列をさらに同定するために,まずこの領域を塩基配列のオーバーラップを含む5つの断片(各36bp)に細分化したプローブを作成し,それぞれのプローブを用いて核蛋白の結合性を検索した結果,-426/-461領域への特異的結合が明らかとなった.(3)短鎖(14-21mer)の合成オリゴヌクレオチドを用いた競合ゲルシフト法にてさらに結合部位の同定を進めた結果,-439/-452領域への結合が示唆された.(4)この部位の塩基配列はCCAAT-enhancer binding protein β(CEBPB)の結合部位コンセンサス配列(TKNNGMAAK)を有し,この蛋白の関与が強く示唆された.(4)CEBPB結合配列およびcore binding siteへの変異を導入した合成オリゴヌクレオチドを作成し,その特異性を検定するとともに,抗CEBPB抗体を用いたsupershift法にて,結合蛋白の同定を進めている.
2. FR遺伝子調節領域特異的結合因子の細胞株特異的発現:(1)-390/-461DNA断片をプローブとして,FRの発現の異なる細胞株を用いて,この結合因子の特異性を検討した.(2)FR高発現細胞株として,KB細胞(親株),Hela細胞,および葉酸拮抗性抗癌剤であるmethotrexate(MTX)耐性KB細胞株C2-MTXRをMTX除去media内で長期培養して得たC2 revertant(C2-Rev,FR高発現)を用いた.FR低発現細胞株として,MTX耐性KB細胞株(C2-MTXR),乳癌細胞株(MCF-7),腎細胞株(MDCK),および腎癌細胞株(ACHN,SN12C,およびTK-10)を用いた.(3)FR高発現細胞株として用いたすべての細胞株で特異的結合が認められた.C2-Revでは親株KB細胞と同程度に認められた.一方,FRの発現が高度に抑制された細胞株であるC2-MTX-Rでは低下し,さらにFRの低発現細胞株すべてにおいてその結合が低下した.(4)薬剤耐性獲得にともなうFRの発現抑制細胞(C2-MTXR)およびFR低発現細胞株の両方にFR遺伝子発現調節領域への結合蛋白の結合の変化が認められたこと,さらにはC2-Revにおいて可逆的結合の再現が認められたことは,この領域でのFR発現調節が高次的または組織特異的発現調節に関与していることが示唆された.
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[Publications] Elwood,P.C.: "The divergent 5'termini of the a human folate receptor(hFR)mRNAs originate from two tissue-specific promoters and alternative splicing: characterization of the a hFR gene structure." Biochemistry. 36・6. 1467-1478 (1997)
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[Publications] Nishimura,R.: "Microsatellite analysis of childhood leukemia and lymphoma: 9p and 12p abnormalities and expression of related genes." Proc Am Soc Clin Oncol. 17. 545a (1998)
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[Publications] Nishimura,R.: "Microsatellite analysis of B-ALL: 9p and 12p abnormalities and expression of related genes." International Journal of Hematology. 67suppl. 90 (1998)
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[Publications] Saikawa,Y.: "Alteration of the transcriptinal factors involved in the human folate receptor gene expression in transport-defective methotrexate-resistant KB cells." International Journal of Hematology. 67suppl. 107 (1998)
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[Publications] Saikawa,Y.: "Alteration of the transcriptinal factors involved in the human folate receptor gene expression in transport-defective methotrexate-resistant KB cells." Blood. 92suppl. 194b (1998)
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[Publications] Wada,H.: "Overexpression of multidrug resistance-associated protein(MRP)gene in refractory B-cell non-Hodgkin's lymphoma." International Journal of Pediatric Hematology Oncology. 5・5. 303-312 (1998)
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[Publications] Sakakibara,M.: "Membrane-type matrix metalloproteinase-1 expression and activation of gelatinase A as prognostic markers in advanced pediatric neuroblastomas." Cancer. 85・1. 231-239 (1999)
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[Publications] Wada,H.: "Selectively induced high MRP gene expression in multidrug resistant human HL60 leukemia cells" Experimental Hematology. 27. 99-109 (1999)
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[Publications] Nishimura,R.: "Inactivated p16 gene in relapsed childhood acute leukemias as a prognostic determinant" Proc Am Soc Clin Oncol. (in press). (1999)
