ミトコンドリア遺伝子異常症の遺伝子治療に関する基礎的研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09670811
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 西條 隆彦 徳島大学, 医学部・附属病院, 助手 (10284291)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒田 泰弘 徳島大学, 医学部, 教授 (20035471)
• Keywords: ミトコンドリア遺伝子 / 遺伝子治療

Research Abstract

Leigh脳症の患者から得た末梢リンパ球をEB virusでtransformし,不死化した.これらの細胞株からミトコンドリアDNAを抽出し,polymarase chain reaction(PCR)/制限酵素切断法で検討したところ,Leigh脳症の患者においてミトコンドリアDNA8993番目のTがGに変異していた.したがって,これらの細胞を宿主細胞として用いることが可能であることが明らかになった.次に,正常ATPase6蛋白発現のためのベクターを作製した.ゲノムDNAとミトコンドリアDNAは一部コドンとアミノ酸の対応が異なるため,細胞質内で正常ATPase6蛋白が合成されるようにするために,ATPase6遺伝子の塩基配列を修正する必要がある.塩基置換を導入したプライマーを用いてPCRを行い,ミトコンドリアATPase6遺伝子の塩基配列を修正したいくつかのDNA断片を増幅した.これらの断片をつなげた後,正常ATPase6蛋白がミトコンドリア内に輸送されるように,ピルビン酸脱水素酵素Elαサブユニット由来のleader sequenceを連結した.このキメラ蛋白をin vitroで発現させ,単離したラット肝ミトコンドリアと混合し,ミトコンドリア内に輸送された蛋白のN末端を決定したところ,Elαのleader peptideが切断された正常ATPase6蛋白が存在していることが明らかとなった.さらにこのDNA断片を真核細胞内発現ベクターであるpREP10に挿入し,発現用プラスミドを完成させた.今後はこのプラスミドを宿主細胞に導入しLeigh脳症の患者においてATPase活性がどの程度修復されるか検討する予定である.