先天性てんかんモデル脳におけるてんかん形成に関連する遺伝子の解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09671000
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 撫井 弘二 大阪市立大学, 医学部, 講師 (20219835)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 勝元 栄一 大阪市立大学, 医学部, 助手 (90271189) ; 木岡 哲郎 大阪市立大学, 医学部, 助手 (40254396) ; 山上 榮 大阪市立大学, 医学部, 教授 (20047004)
• Keywords: Elマウス / RAP-PCR / SEIZURE / てんかん / mRNA

Research Abstract

てんかんの原因や病態を解明するため、様々な実験モデル動物を用いて検討を加えられているが、現在なお不明な点が多い。今回の研究では、ヒトの複雑部分発作の自然発症モデルといわれるElマウスを用いて、てんかん形成過程で誘導されてくる遺伝子の同定を試みた。
生後100日前後で、生後28日より放り上げ刺激を反復することにより発作準備性を獲得したEl(s)マウスと、刺激を与えず発作準備性を獲得していないEl(ns)マウスの脳よりシングルステップ法によりtotalRNAを調製し、市販のRAPPCRキットと^<32>P-dCTPを用いてcDNAの合成およびRNA arbitrarily primed PCRを行った。PCR産物を4%polyacrylamide-7Murea sequencing gelで電気泳動を行った後、オートラジオグラフィーを行った。
El(s)、El(ns)とで差異のあった20本のバンドをゲルより切り出し、TE Bufferを加えて煮沸し、PCR産物を抽出し、セカンドPCRを行った後、pBSKIIにサブクローニングした。大腸菌(DH5α)にトランスフォームした後、培養し、プラスミドDNAを回収した。市販のシークエンスキットを用いてシークエンスを行い塩基配列を決定した結果、5個のPCR産物は既知のものであった。そのうち2つはミトコンドリアに存在する遺伝子で、ほかはニューレキシン、グルタメートA受容体およびアクチン遺伝子であった。本法ではpseud positiveになる場合があるので、Northen blottingによりそれぞれのPCR産物について、実際にEl(s)、El(ns)で差異のある遺伝子産物を現在確認中である。なおニューレキシン遺伝子については、両群で差異を認めなかった。