テロメラーゼ活性新測定法による癌の診断と治療への応用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09671239
• Research Institution: Sapporo Medical University School of Medicine
• Principal Investigator: 大村 東生 札幌医科大学, 医学部, 助手 (30295349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡辺 直樹 札幌医科大学, 医学部, 教授 (10158644) ; 平田 公一 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50136959) ; 秦 史壯 札幌医科大学, 医学部, 助手 (70291557) ; 八木橋 厚仁 札幌医科大学, 医学部, 講師 (40260757) ; 岡崎 亮 札幌医科大学, 医学部, 講師 (50213921)
• Keywords: テロメラーゼ / TRAP法 / テロメラーゼ関連遺伝子

Research Abstract

テロメラーゼ活性測定を癌診断に応用することを目的として、昨年度は、非放射性プローブを用いたテロメラーゼ活性測定法を開発し、その感度試験を行った。ヒ卜テロメラーゼのRNA componentであるhTRが、1995年にクローニングされ、Northern blotting、RT-PCR法などで解析が試みられでいる。しかし、hTRを測定することの臨床的意義については未だ統一した見解が得られていない。そこで、本年度は、hTR測定の臨床的意義を明らかにするため、蛍光色素を用いた定量的PCR法であるTaqMan RT-PCR法を開発した。hTRおよびGAPDHのプライマーとプローブはhTR(F):5′-GGTGGTGGCCATTTTTTGTC-3′、hTR(R):5′-CTAGAATGAACGGTGGAAGGC-3′、hTR(Probe):5′-CGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTC-3′、GAPDH(F):5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′、GAPDH(R):5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′、GAPDH(Probe):5′-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3′を使用した。プローブはFAMとJOEの2種の蛍光色素でラベルし使用した。シグナルの検出は、ABI Prism 7700seguence Detectorで行った。膵癌細胞株MIAPaCa-2、ASPC-1を用いた検討ではRNAの初期鋳型量を正確に検証できた。更に従来法に比べ、短時間でありContaminationが起こりにくく、プローブを使用することにより特異性が高く、かつ定量的であった。また、この方法は、テロメラーゼ関連遺伝子hTERT、およびTEPI mRNAの検出に応用できることから、テロメラーゼ活性とテロメラーゼ関連遺伝子の関係を明らかにするために有用な方法であると考えられた。

Research Products

• [Publications] Wada Y: "Norradioisotopic telomeric repeat amplification protocol(TRAP)using digoxigenin labeled probe" Immunopharmacology and Immunotoxicology. 19(4). 451-457 (1997)
• [Publications] Yajima T: "Quan titative reverse transcription-polymerase reaction assay of the RNA component of human telomerase using the Taqman fluorogenic detection system" Clinical Chemistry. 44(12). 2441-2445 (1998)
• [Publications] Kameshima H: "Helicobactor pylori infection induces telomerase activity premalignant leisions" American Journal of Gastroenterology. 94(2). 547-548 (1999)