不死化ヒト肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09671254
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 片山 時孝 東海大学, 医学部, 助手 (40214332)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上山 義人 東海大学, 医学部, 助教授 (30072408) ; 猪口 貞樹 東海大学, 医学部, 助教授 (60160008)
• Keywords: ハイブリッド型人工肝臓 / 不死化 / 初代培養肝細胞 / アデノウイルスベクター / 遺伝子導入 / SV40T抗原 / 形質転換コロニー

Research Abstract

目的 初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の研究開発が進んできている。しかし初代培養肝細胞は、通常の培養条件では数週間程度しか維持させることができず、次々と死滅していく。また、初代培養肝細胞は安定供給も難しく、これらのことが初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓作製にあたっての大きな制限となっている。私は、アデノウイルスベクターを用いるとラットおよびサル初代培養肝細胞にSV40初期遺伝子を導入、形質転換させうること、長期継代培養、不死化さらに大量培養が行えることを見いだした。今回同様の方法によりヒト肝細胞の不死化(平成9年度)およびこれを用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みたい。 方法および結果 1.組み替えウイルスベクター感染後のSV40T抗原一過性発現率:ヒトアデノウイルス5型のE1A、E1B遺伝子を複製能欠損SV40初期遺伝子と組み替えたアデノウイルスベクターを種々のMOI(multiplicity of infection)でヒト初代培養肝細胞に添加し37℃にて2時間培養、さらに48時間培養後にエタノール固定し、抗SV40T抗原抗体を用い免疫染色を行った。T抗原陽性率はMOI 100では約20%、MOI 10では約4%、MOI 1では0.5%以下であり、MOIに依存性であった。2.組み替えウイルスベクター感染後の形質転換コロニー形成率:MOI 100で組み替えベクターをヒト肝細胞に感染させ1×10^6/flask(25cm^2)となるようにplatingした。この状態で3〜4週間培養を続けると10^6個に対して約100個の形質転換コロニーが出現した。3.長期継代培養と不死化:SV40初期遺伝子導入ヒト肝細胞をbu1k状態で継代培養し続けたところ9か月以上にわたって良好に増殖を示しており不死化したと考えられる。このようにして継代培養した肝細胞にSV40T抗原の免疫染色を施行したところ、ほとんどの細胞でSV40T抗原が陽性であった。 結語 組み替えウイルスベクターを用いると効率よくヒト肝細胞へのSV40初期遺伝子導入、形質転換が可能であり、不死化が行えた。