不死化ヒト肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09671254
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 片山 時孝 東海大学, 医学部, 助手 (40214332)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上山 義人 東海大学, 医学部, 助教授 (30072408) ; 猪口 貞樹 東海大学, 医学部, 助教授 (60160008)
• Keywords: 初代培養用細胞 / アデノウイルスベクター / 遺伝子導入 / SV40T抗原 / 形質転換コロニー / 不死化 / ハイブリッド型人工肝臓

Research Abstract

【目的】初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の研究開発が進んできている。しかし初代培養肝細胞は、通常の培養条件では数週間程度しか維持させることができず、次々と死滅していく。また初代培養肝細胞は安定供給も難しく、これらのことが初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓作製にあたっての大きな制限となっている。私は、アデノウイルスベクターを用いるとラットおよびサル初代培養肝細胞にSV40初期遺伝子を導入、形質転換させ得ること、長期培養、不死化さらに大量培養が行えることを見いだした。今回同様の方法によりヒト肝細胞の不死化(平成9年度)およびこれを用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みた。【方法および結果】1.in vitroでalbumin合成、Urea産生能、Tyrosineaminotransferrase(TAT)活性を測定した:長期継代培養していくと単層培養では経時的にalbumin合成、Urea産生能、TAT活性の低下が認められ肝細胞機能が減弱していくことが観察された。2.SCID(severecombined immuno deficiency)mouse移植しin vivoでの機能解析=10^2個、10^3個、10^4個の不死化ヒト肝細胞をSCID mouseの背部皮下に移植し4週間後にsacrificeし癌化していないことを確認した。3.不死化ヒト肝細胞をpoly-N-p-vinylbenzyl-β-D-lactonamide(PVLA)修飾シャーレ上で3次元培養を試みた:PVLAシャーレ上での単層培養は安定して行えているが3次元培養は、今年度まだ安定して行えていない。【結語】単層培養では経時的に肝細胞機能が減弱していくことがin vitroでの機能解析により明らかとなった。このため今後は、機能をよりよく温存する可能性が高い3次元培養を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みたい。