悪性黒色腫細胞株(SSM-1)の浸潤・転移に関する免疫組織学的分子生物学的検討

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09672075
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kanagawa Dental College
• Principal Investigator: 水谷 成孝 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (40200000)
• Keywords: 悪性黒色腫 / 細胞培養 / 転移 / 浸潤 / MMP-2 / MMP-9 / カドヘリン

Research Abstract

口腔悪性黒色腫は強い浸潤性増殖能と転移巣形成能を有する。私は高メラニン色素産生能を有する本腫瘍の株化(SSM-1)に成功し、浸潤・転移巣形成能のメカニズムについて研究を行った。今回はコラーゲン・ゲル培養法を用い、単層培養法の欠点である、分化機能の喪失を防ぎ、細胞の三次元的形態、組織構築が観察でき,その結果以下を得た。
1.継代培養した悪性黒色腫株をプラスチックシャーレがconfluentになった時期に浮遊液とし、コラーゲン・ゲル培養キットを用い3次元培養を行った。Eagle MEM培地にて細胞浮遊液は1×10^5/mlとしたが、細胞がゲル中にconfluentになるには2〜3週間を要し、その間にゲルは収縮しシャーレ中に浮遊するようになった。
2.3次元培養でconfluentになった時期に10%中性緩衝ホルマリン固定した。パラフィン包埋4ミクロン切片、H-E染色を行い顕鏡、写真撮影を行った。細胞は紡錘形で、樹枝状突起を出し、2次元培養とは異なった形態で、より生体に近い形態を得られた。
3.このホルマリン固定、パラフィン切片についてヒト-E-エカドヘリンの免疫組織化学的染色を行った。当初、ABC法においてを行う予定であったが、染色の安定性を考え、SAB法にておこなった。その結果、腫瘍細胞ではほとんど染色されなかった。
4.in vitroで黒色腫と間質細胞との反応をみるために線維芽細胞の初代培養を行った。継代後、3次元培養でコロニー状になったSSM-1と線維芽細胞の浮遊液とを混合し、培養した後、同様の方法で染色を行った結果、腫瘍細胞が胞巣状にみられ、その周囲に線維芽細胞が増殖し、腫瘍の浸潤モデルができたことが確認された。ヒト-E-エカドヘリンの免疫組織化学的染色ではわずかながら細胞の輪郭にそって染色されていた。
5.MMP-2の免疫染色は来年度に回し、PCR法での検索を行い、バンド検出を確認した。