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1998 Fiscal Year Annual Research Report

マルチ銅酵素の基質特異性に対する遺伝子工学的研究

Research Project

Project/Area Number 09672205
Research InstitutionFukuyama University

Principal Investigator

廣瀬 順造  福山大学, 工学部, 教授 (70080215)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 岩本 博行  福山大学, 工学部, 講師 (90213321)
Keywordsアスコルビン酸オキシダーゼ / ビリルビン・オキシダーゼ / マルチ銅酵素
Research Abstract

我々はエビタケ由来(Trachyderma tsunodae K-2593)のピリルビンオキシダーゼ(BOD(Tra))と微生物由来(Acremonium sp HI-25)のアスコルビン酸オキシダーゼ(AOD(Acr))が、いずれも活性部位にType 1,Type 2,Type 3銅を持つマルチ銅酵素であることを明らかにした。我々はBOD(Tra)遺伝子の酵母内での発現系の構築とAOD(Acr)の性質について研究を進めている。
1) BOD(Tra)遺伝子の発現系の構築の試み
昨年度は高発現系ベクターpYE22m(GAPプロモーター)を用いてパン酔母(Saccharomyces crevisiae)での発現を試みたがうまく行かなかった。そこでpYE22mにつないだBOD(Tra)遺伝子(W-7)の両端のシークエンスを読み直したところ、アダプター配列中にNcoIサイトがあることが判った。NcoIサイトにはATGの開始コドンがあり、ここから蛋白質の翻訳が始まってしまい、フレームがずれるために、BOD(Tra)が発現しなかったと推定された。そこで、高発現ベクターpYES2を用いてHin IIIサイトにBOD(Tra)遺伝子(W-7)を組み込み、出芽酵母(Saccharomyces crevisiae)中での発現を試みた。遺伝子が酵母で発現し、BOD(Tra)を生産しているかどうかを確認するために、上清と菌体の酵素活性を測定したが活性は示さなかった。また、蛋白を確認するためにSDS-PAGEを行い、ブロッティングしBOD(Tra)と思われるバンドのN-末端アミノ酸配列を見たが、BOD(Tra)ではなかった。
2) AOD(Acr)の性質
アスコルビン酸オキシダーゼの基質として、その酸化還元電位がどのpHでも一定であるフェロシアンイオン(Fe(CN)_6^<4->)を使用し、そのKm及びkcatのpH依存性を検討した。Km及びkcatのpH依存性は、基質をアスコルビン酸にした場合と大きく異なっていた。

  • Research Products

    (4 results)

All Other

All Publications (4 results)

  • [Publications] J.Hirose et al.: "Anions binding to bilirubin oxidase from Trachyderma tsunodae." Inorganica Chimica Acta. 273. 204-212 (1998)

  • [Publications] K.Fukazawa et al.: "Dipeptidyl peptidase III is a metalloenzyme." Biochem.J.329. 275-282 (1998)

  • [Publications] K.Fukazawa et al.: "Rat liver aminopeptidase B:Mutational analysis of putative..." Biochem.J.(in press). (1999)

  • [Publications] J.Hirose et al.: "The dependence of the copper dissociation rate constants from.." Inorganic Reaction Mechanism. (in press). (1999)

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Published: 1999-12-11   Modified: 2016-04-21  

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