1997 Fiscal Year Annual Research Report
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09672214
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
柏木 敬子 千葉大学, 薬学部, 助手 (80169424)
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| Keywords | ポリアミン輸送 / プトレスシン / スペルミジン / 遺伝子発現調節 / PotD / PotE / PotF / 基質結合蛋白質 |
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| Research Abstract |
1.大腸菌のプトレスシン排出系蛋白質PotEはプトレスシンの取り込みと排出の両活性を有する。排出はプトレスシン・オルニチンアンチポ-タ活性によりエネルギー非依存的に行われ、取り込みは膜電位依存性であった。PotEとalkaline phophatase及びβ-galactosidaseとの様々なfusion proteinを作製した結果、PotEは12個の膜貫通部位を持ち、N未満及びC未満が細胞質側に存在するトポロジーを有していた。PotE中の16個の酸性アミノ酸残基を変異した変異PotEを作製し、両活性を測定した結果、Glu207が取り込みと排出に必須であり、Glu77とGlu433も両活性に関与していた。PotE蛋白質はプトレスシン排出及び取り込み活性を持ち、細胞質側にその活性中心を有することが明らかとなった。
2.スペルミジン優先取り込み系(potABCD operon)の発現は基質結合蛋白質であるPotDとスペルミジンにより転写レベルで阻害された。従ってPotDはbifunctional proteinとして機能している。このPotDの結合部位をgel shift assayにより調べたところ、mRNAの開始コドンの240塩基上流付近と100塩基下流付近の2ヵ所存在していた。細胞内ポリアミンが上昇すると、PotD蛋白質は細胞内に留まり、potABCD operonの発現を負に調節することが示唆された。
3.プトレスシン取り込み系を構成する基質結合蛋白質PotFの構造とプトレスシン結合部位を、X線結晶構造解析及び、1アミノ酸残基置換変異PotFを作製することにより明らかにした。基質プトレスシンの結合にはNドメインのTrp37、Ser38、Asp39、Tyr40、Ser85、Ser87、CドメインのGlu185、Trp244、Asp247、及びリンカー領域のPhe276、Asp278が関与していた。
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Research Products
(6 results)
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[Publications] K.Igarashi et al.: "Molecular mechanism of polyamines stimulation of the synthesis of oligopeptide binding protein." J.Biol.Chem.272. 4058-4064 (1997)
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[Publications] K.Kashiwagi et al.: "Excretion and uptake of putrescine by the PotE protein in Escherichia coli." J.Biol.Chem.272. 6318-6323 (1997)
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[Publications] J.Chao et al.: "N^1-Dansyl-spermine and N^1-(n-octanesulfonyl)-spermine,novel glutamate receptor antagonists : block and permeation of N-methyl-D-aspartate receptors." Mol.Pharmacol.51. 861-871 (1997)
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[Publications] K.Kashiwagi et al.: "Block and modulation of N-methyl-D-aspartate receptors by polyamines and protons. Role of amino acid residues in the transmembrane and pore-forming regions of NR1 and NR2 subunits." Mol.Pharmacol.52. 701-713 (1997)
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[Publications] K.Igarashi et al.: "Benzyl-polyamines ; Novel.potent N-methul-D-aspartate receptor natagonists." J.Pharmacol.Exp.Ther.283. 533-540 (1997)
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[Publications] T.Fukuchi-Shimogori et al.: "Malignent transformation by overproduction of translation initiation factor eIF4G." Cancer Res.57. 5041-5044 (1997)
