ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群における疾患感受性の解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09672367
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 町田 勝彦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (70056886)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 緑 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (00225385) ; 保科 定頼 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (30119846) ; 桜井 進 河野臨床検医学研究室, 主任研究員 (20056542) ; 上出 良一 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (40119780)
• Keywords: 黄色ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群 / ブドウ球菌性表皮剥脱素 / フィブロネクチン

Research Abstract

今年度の研究日標は黄色ブドウ球菌性表皮剥脱素血清型A(ETA)の標的物質の解析に重点をおいた。ETAによってin vitroで切断されたヒト血漿由来フィブロネクチン(FN)、分子量460kDaをゼラチン セファロースカラムによるアフィニティークロマトによって分画し、0.05M酢酸ナトリウムpH5.0で溶出される分画をSDS-7.5%PAGEにかけた後、セミドライ法でクリアブロット-P膜に転写し、coomassie brilliant blue G-250染色によって検出した90kDa、70kDa、50kDa分別帯のうち、70kDa分別帯のN末端アミノ酸配列を決定した。この70kDa断片のN末端アミノ酸配列は、FNのN末端から1439残基目の後流の配列に相当していた。70kDaのN末端アミノ酸配列を基にして24merのオリゴヌクレオチドプライマー(ETA5)を作製した。
新産仔マウスならびに生後10日のマウスからmRNAを分離し、各々のcDNAライブラリーを調整した。これらのcDNAをBamH Iで消化し、LA PCR in vitro Cloning(TAKARA)を用いてSau3A Iカセットを連結し、カセットプライマーC1およびETA5をプライマーとしてPCRを行った結果、分子サイズは280bpのバンドを得た。これをpUC19に連結して大腸菌に導入し、そのtransformantからrecombinant plasmidを調整した。これを鋳型としてsequencing primer(M13 primer M4,RV)を用いてPCRを行い、280bp断片が増幅される複数のrecombinant plasmidが得られた。これらのrecombinant plasmidを精製し、現在、塩基配列の解析を進めている。なお、次年度にはETAの標的物質(基質)を決めて、それに対する抗体を作製する予定である。

Research Products

• [Publications] 桜井 進: "黄色ブドウ球菌表皮剥脱毒素の構造と機能ならびに毒素遺伝子の発現調節機構" 河野研研究年報. 46. 33-47 (1996)
• [Publications] Susumu Sakurai: "Genetic and biochemical studies on staphylococcal exfoliative toxin and expression of the cloned toxin gene from Staphylococcus aureus in Escherichia coli" Archives of Kohno Clini.Med.Res.Ins.12. 9-22 (1997)
• [Publications] Susumu Sakurai et.al.: "New evidence showing that the Try-157 and Try-159 residues of staphylococcal exfoliative toxin B are essential for its toxicity and antigenicity" Microbiology Immunology. (発表予定).