新しい高感度DNA損傷検出法による環境汚染物質の生態毒性評価

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09680532
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 岩堀 恵祐 静岡県立大学, 環境科学研究所, 助教授 (40183199)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮田 直幸 静岡県立大学, 環境科学研究所, 助手 (20285191) ; 下位 香代子 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助手 (10162728) ; 木苗 直秀 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (00046286)
• Keywords: コメットアッセイ / DNA損傷 / 電気泳動 / Lysis / タイプカルチャー / リンパ球 / γ線照射

Research Abstract

コメットアッセイ法は従来、ヒト末梢血リンパ球やマウス肝初代培養細胞などを使用してきた。しかし本研究では、環境汚染物質の生態毒性を評価することが目的であるので、毒性影響を最初に破る各種の微生物を対象とした。このため、DNA損傷を確実に生じさせるγ線照射(20分)とリンパ球を対照系として、供試微生物には、酵母Saccharomyces cerevisiae、植物性鞭毛虫であるEuglena gracilisとMonas guttula、緑藻類Chlamydomonas pulstatillaを用いた。コメットアッセイ法の操作因子として、アルカリ易溶出部位に影響を与える電気泳動時間、Lysisの時間とpHが想定でき、既往研究の成果を考慮して、泳動時間を30〜60分に、Lysisの時間とpHを1〜4時間と8〜13にそれぞれ設定した。なお、各測定ともγ線照射のないコントロール系を併用した。その結果、S.cerevisiaeやC.pulstatillaはアルカリ易溶出部位が検出されなかったため、本法の試料に適さないことがわかった。また、M.guttulaの継代培養には被捕食微生物のMicrocystis aeruginosaが必要で、M.guttulaのコメットのみを蛍光顕微鏡で判別することが難しかった。E.gracilisの場合には、どの操作条件でも実験系とコントロール系でコメットが確認されたが、Tail lengthでの評価では、泳動時間60分でLysis時間2時間で両者に差異が認められ、DNA損傷の定量化の可能性が示唆された。対照系であるリンパ球では、泳動時間30分でLysis時間1時間、pH10程度が適性な条件であり、コントロール系ではほとんどコメットが現れなかったことを鑑みると、供試する細胞の由来により、操作条件が異なることが明らかとなり、コメットアッセイ適用上の問題点を指摘することができた。