1998 Fiscal Year Annual Research Report
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09680589
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
原 三郎 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (00028193)
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| Keywords | キチナーゼ / イネゲノム / クローニング |
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| Research Abstract |
米ヌカより単離・精製したキチナーゼRS-9Kのアミノ酸配列に基づき、BamHI切断部位を末端に持つN末端側およびC末端側のプライマーを合成した。イネ子葉からゲノムDNAを抽出し、合成したプライマーを用いてPCR法によりキチナーゼ9KのcDNAを増幅した。得られたキチナーゼRS-9KDNAを配列分析用のベクターにサブクローニングし、DNA Sequencerにて塩基配列を分析して、キチナーゼRS-9Kのアミノ酸配列と相同な塩基配列を持つベクターを選別した。このベクターを導入して形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドDNAを抽出後、制限酵素BamHIによってBamHI-9KDNAを切り出した。得られたキチナーゼDNAはトランスファーベクターpAcGP67aにライゲーションした。これをヨトウガ細胞に感染するウイルスDNAとco-transfectionすることにより、組み換えウイルスを作成した。しかし、この系によるタンパク質の発現は認められなかった。次に大腸菌発現系を用いるために、キチナーゼDNAをpET vector,pMAL vectorにそれぞれライゲーションし、発現条件で発現を試みた。しかし、キチナーゼの発現は認められなかったため、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)とのフュージョンタンパク質として大腸菌で発現する系を採用した。発現したタンパク質はグルタチオン力ラムにより、1ステップで単離・精製された。発現タンパク質は、SDS-PAGEにより、フュージョンタンパク質であることが確認された。精製したGST-9Kフュージョンタンパク質はPreScission^<TM> ProteaseによりGSTとキチナーゼ9Kを切断し、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィーを用いることに精製した。しかし、精製リコンビナントキチナーゼ9Kにはキチナーゼ活性はなく、現在、発現タンパク質を活性型で発現する、酵母(Pichia)による発現系による発現を試みている。
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[Publications] Manabu Shiga et al.: "Pectinolic enzymes from Pseudomonas marginalis MAFF 03-01173" Phytochemistry. 45巻7号. 1359-1363 (1997)
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[Publications] Ryo Takano et al.: "Concurrence of agaroid and carrageenan chains in funoran from red seaweed Gloipeltis furcata Post et Ruprecht(Cryptonemiaales,Rhodophyta)." Carbohydrate Polymers. 35巻. 81-87 (1998)
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[Publications] Isao Maruta et al.: "Enzymic digestibility of reduced-pressurized,heat-moisture treated starch." Food Chemistry. 61巻. 163-165 (1998)
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[Publications] Koji Ikura et al.: "An established hybridoma clone producting a monoclonal antibody against Vibrio anguilarum." Biosci.Biotech.Biochem.61巻11号. 1939-1941 (1997)
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[Publications] Ryo Takano et al.: "Specific 6-O-desulfation of heparin." Carbohydorate Letters. 3巻. 71-77 (1998)
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[Publications] Ryo Takano et al.: "Variety in backbone modification of red algal galactan sulphates." Recent research developments in phytochemistry. 1巻. 195-201 (1997)
