UDPグルコースピロホスホリラーゼの基質複合体のX線解析による反応機構解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09680591
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 楠木 正巳 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教授 (90135749)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷澤 克行 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20133134)
• Keywords: 酵素 / X線解析 / 反応機構

Research Abstract

UDP-グルコースピロホスホリラーゼは、ウリジン三リン酸とグルコース1ーリン酸からUDP-グルコースとピロリン酸を生成する可逆反応を触媒する酵素である。ジャガイモ由来の酵素の立体構造は既に我々のグループによるX線結晶解析により2.2Å分解能による解明されており、親和標識実験から知られている5個のリジン残基の位置から活性部位の位置が推定されている。
今回の研究のためにジャガイモ由来の本酵素を大腸菌での大量発現系から大量発現し、各種複合体のX線結晶解析と時間分割の解析に必要な量の酵素を調整・精製し、結晶化した。
本酵素の酵素反応はOrdered Bi Bi機構によって進む。ウリジン三リン酸、UDPグルコースと本酵素が結合することが予測される。本酵素とこれらの基質との複合体は、酸素のnative 結晶をこれらの基質を含む結晶化母液に浸けることにより作成し、X線回折パターンをイメージングプレートX線回折計で測定した。現在、差電子密度を計算中である。差電子密度の解析から、これら基質の結合部位が解明される予定である。
時間分割による酵素反応機構の予備実験のため、加速器研究機構、物質構造科学研究所の放射光実験施設の蛋白質ビームライン18Bにおいて、ラウエ法による本酵素のnative結晶のラウエ写真を測定し、回折強度データ処理を行い、電子密度図を得た。これにより、本酵素がラウエ法による時間分割構造解析に耐えうる結晶であることが確認でき、今後の研究の展望が開けた。