1997 Fiscal Year Annual Research Report
インターロイキン1αの細胞内局在におよぼすリン酸化の役割
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09680633
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
渡辺 直子 東邦大学, 理学部, 助教授 (80230978)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 芳郎 東邦大学, 理学部, 教授 (10134610)
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| Keywords | インターロイキン1α / 細胞内局在 / リン酸化 / 核移行シグナル / 融合タンパク質 |
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| Research Abstract |
1.β-ガラクトシダーゼ(β-gal)と融合させたインターロイキン1α(IL-1α)発現プラスミドの作製
リン酸化部位を含む(野生型)または含まないIL-1α前駆体は、終止コドンをBamHI部位となるように変異させた。また、IL-1α前駆体部分の核移行シグナル配列を含む領域についてリン酸化部位を含むものと含まないもの、さらにIL-1α成熟体部分を3'末端にBamHI部位を持つようにPCRによって増幅した。得られたそれぞれのBamHI断片を発現ベクターに挿入し、C末側でβ-galと融合タンパク質として発現するようなプラスミドを作製した。
2.IL-1α/β-gal融合タンパク質発現細胞におけるβ-gal活性の検出
上記で作製した融合タンパク質発現プラスミドDNAをリン酸カルシウム法によりマウス線維芽細胞NIH/3T3にトランスフェクションし、2日後に細胞を固定した後、β-galの基質であるX-galを加えて青色の発色を観察した。核移行シグナルを付加したβ-galは核に、核移行シグナルを持たないIL-1α成熟体とβ-galとの融合タンパク質は細胞質に局在が認められた。IL-1α前駆体との融合タンパク質は発現量が低く局在を特定できなかったが、IL-1α前駆体部分の核移行シグナル配列を含む領域との融合タンパク質は、リン酸化部位の有無にかかわらず核に局在が見られたことから、リン酸化は局在に影響を与えていないように思われた。しかし、これらIL-1α前駆体の一部の領域とIL-1α前駆体とではコンホメーションが大きく異なり、その違いが局在に影響を及ぼしている可能性を否定できないため、今後、IL-1α前駆体の発現を上げるまたはより感度の高い融合タンパク質としての検出を試みる予定である。
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[Publications] Kobayashi,Y.et al.: "Interaction of the pre-domain of interleukin-1 with the mature domain" J.Biochem.121. 896-901 (1997)
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[Publications] Kobayashi,Y.et al.: "Target cell-induced calcium signals in human natural killer leukemia cells as revealed by confocal fluorescenece microscopy" Exp.Cell Res.232. 42-46 (1997)
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[Publications] Yamashiro,T.et al.: "Reduction of intracellular pH by inhibitors of natural killer cell activity,nicardipine,metlyl 2-(N-benzyl-N-methylamino)ethyl-2,6-dimethyl-4-(2-isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyridine-3-yl)1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate(AHC-52)and 4,4-dilsothiocyano-2,2'-disulfonic acid stiliene(DIDS)" Biochem.Pharmacol.54. 143-148 (1997)
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[Publications] Uchimura,E.et al.: "Modulation by lipopolysaccharide of inflammatory cytokine production by two T cell lines" Cytokine. 9. 727-733 (1997)
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[Publications] Uchimura,E.et al.: "Interaction of phagocytes with apoptotic cells leads to production of pro-inflammatory cytokines" Biochem.Biophys.Res.Comm.239. (799-803)
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[Publications] Watanabe,N.et al.: "Apoptosis induced by nigericin is independent of activation of interleukin-1β converting enzyme." Cytokine. (in press).
