1998 Fiscal Year Annual Research Report
レセプターがG蛋白質αサブユニットを活性化する機構
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09680645
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| Research Institution | GUNMA UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
若松 馨 群馬大学, 工学部, 助教授 (40222426)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 俊之 三菱化学生命科学研究所, 構造解析研究室, 研究員
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| Keywords | G蛋白質 / CD / マストパラン / compound 48 / 80 / 活性化 / レセプター / 突然変異体 / βγサブユニット |
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| Research Abstract |
1. レセプター刺激に伴うG蛋白質αサブユニットの二次構造変化: レセプターと同様にG蛋白質を活性化できるマストパランとcompound48/80は何れもGi1αのαヘリックス含量を減少させた。また、活性化のEC50と二次構造変化のEC50は何れも30μg/mlと等しかった。そこで、レセプター刺激によってαサブユニットのαヘリックス含量が減少し、その構造変化がGDP解離を促進している事がわかった。
2. Gi1α突然変異体の活性化とグアニンヌクレオチド結合特性: αサブユニットのレセプター結合部位にあるα5ヘリックス中の2つのアスパラギン酸(D337,D341)はβ2-β3ループに存在するリジン(Kl92)とイオンペアを形成しており、β2ストランドの先にはグアニン結合部位が存在する。そこで「レセプター刺激によってα5ヘリックスのほぐれが起り、その結果GDPの解離が促進される」と考えられる。この2つのアスパラギン酸をアラニンに置換した突然変異体はcompound48/80によってαヘリックス含量は減少したが、GDP解離の促進は起こらなかった。また、m2ムスカリンレセプターによる活性化の程度は低かった。これらの現象は上記の仮説を裏付けている。さらに、K192・D337・D341のそれぞれをアラニンに置換した突然変異体を調製しそのGDP特性を調べたところ、いずれもGDPの解離速度がwild typeに比べて速かった。そこで、イオンペアはGDPのαサブユニットへの安定な結合に重要であることがわかった。
3. G蛋白質βγサブユニットの効率的な精製法の確立: βγサブユニットの精製には従来多種類のクロマトグラフィーを組合せる必要があり、時間と労力がかかった。Gi1αをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーの条件を検討することによって、1ステップでβγを精製する方法を確立した。
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[Publications] T. Tanaka,K. Wakamatsuら: "α Helix content of G protein α subunit is decreased upon activation by receptor mimetics" J. Biol. Chem.273. 3247-3252 (1998)
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[Publications] K. Kusunoki,K. Wakamatsuら: "G protein-bound conformation of mastoparan-X" Biochemistry. 37. 4782-4790 (1998)
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[Publications] T. Kohno,K. Wakamatsuら: "A new general method for the biosynthesis of stable isotope-enriched peptides using a decahistidine-tagged ubiquitin fusion system" J. Biomol. NMR. 12. 109-121 (1998)
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[Publications] T. Tanaka,K. Wakamatsuら: "One-step affinity purification of the G protein βγsubunits from bovine brain using a histidine-tagged G protein α subunit" Prot. Expr. Purif.15. 207-212 (1999)
