立体構造に基づくシグナル伝達超分子系でのスイッチ機構の実時間計測

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09680654
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Himeji Institute of Technology
• Principal Investigator: 中川 将司 姫路工業大学, 理学部, 助手 (00212085)
• Keywords: 視覚 / ロドプシン / G蛋白質 / シグナル伝達 / 蛍光ラベル / 蛍光エネルギー移動法 / 蛋白質間相互作用 / 実時間計測

Research Abstract

申請書に記載した研究実施計画に沿って研究を行った。その結果を以下に記す。
【測定装置の調整】ユニバーサルホトンカウンティングシステムによる、ロドプシンの光活性化に伴う蛍光変化を計測できる系を確立した。その結果、蛍光励起光による影響が無視できるくらいの微弱光でミリ秒レベルの時間分解能での測定が可能になった。
【種々の蛍光色素のスクリーニング】種々の蛍光試薬を用いて、タコロドプシン、タコG蛋白質(Gqp)の蛍光標識を試みた。どちらの蛋白質においてもほぼ1対1で標識出来る条件を確立した。ロドプシンはラベルよる影響を殆ど受けなかったが、Gqpは、現在のところ、活性を維持したままのラベルは難しい。しかし、そのGqpはGTP交換反応能を失ったものの、ロドプシンと結合することがGqpにラベルした蛍光色素からロドプシンのレチナ-ルへの蛍光エネルギー移動の測定により分かった。そして、Gqp蛋白質は光活性化状態になったロドプシンを認識して結合するのではなく、光活性化以前からロドプシンと結合していることが明らかになった。
【mant-GTP】蛍光標識されたGTP(mantGTP)を用いて、G蛋白質の活性化の実時間計測を試みた。まず、ウシ視細胞から精製したG蛋白質(Gt)を用いてその有用性を検討した。その結果、ウシロドプシンの光活性化に伴うGtのmantGTPの結合を実時間で測定することに成功した。Gt自身の加水分解能による生じたmantGDPは、Gtとの親和性が低く、すぐに解離する事が分かった。それにより蛍光強度の減少が生じ、GTPの加水分解速度も測定できること分かった。最近GTPの加水分解速度を著しく促進させる蛋白質(RGS)が、シグナル伝達機構のオフに関与しているとして注目を浴びている。この系を用いることによりその機能を詳しく調べることが出来るものと期待される。

Research Products

• [Publications] Nakagawa, M.: "Identification of Two Palmitoyl Groups in Octopus Rhodopsin" Photochem. Photobiol.65. 187-191 (1997)
• [Publications] Nakagawa, M.: "Light-Induced Protein Conformational Changes in the Photolysis of Octopas Rhodopsin" Biophys. J.72. 2320-2328 (1997)