1997 Fiscal Year Annual Research Report
新規神経ペプチド(HCNP)受容体の同定と単離および構造解析
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09680769
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
小鹿 幸生 名古屋市立大学, 医学部, 講師 (20177223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森下 学 名古屋市立大学, 医学部, 研究員
継 泰城 名古屋市立大学, 医学部, 助手 (40285218)
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| Keywords | 神経ペプチド / HCNP / 海馬由来神経刺激因子 / 受容体 / 中枢神経 / コリン作動性神経 / RRA |
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| Research Abstract |
前脳基底野コリン作動性神経の分化(コリンアセチル転移酵素の産生誘導)を促進する新規神経ペプチド(HCNP;hippocampal cholinergic neurostimulating peptide)の受容体または結合成分の検討を実施し以下の結果を得た。
1.Radiolabeled receptor assay (RRA)系の確立とその特性の解析:脳組織を10倍容の氷冷0.32Mショ糖溶液中でホモジナイズ後、遠沈法でP1(核分画)、P2(mitochondria-synaptosome分画)、P3(microsome分画)及び可溶性分画に分離した。N末端のアセチル基を除いたラットHCNP(free HCNP)をBolton-Hunter法でヨード化し、0.3%BSAを含むRRA容液(50mM Tris-HCl,pH7.6)で希釈して標識リガンド(762GBq/mmol)とした。200μlの各分画に0.343MBqの^<125>I-HCNPを加え総容量300μlとし、30℃で60分インキューベーションした。氷冷RRA容液1mlを加えWhatman GF/Fフィルターを用い非結合を除去し、標識リガンドの結合が非標識リガンド(1nmol/assy)で置換された結合を特異的結合とした。1ヶ月齢ラット脳のP2に74.9%、P3に14.9%、P1に9.0%、可溶性分画に1.2%の特異的結合が認められた。また、^<125>I-HCNPの特異的結合は大脳皮質領域のP2に多く、他領域には少なかった
2.可溶化細胞膜成分のRRA系の確立:Mannon,P.J.et.al.(J.Neurochemi.56;1804-9,1991)に準じ各種蛋白分解酵素阻害剤を含む氷冷20mM HEPES buffer A(pH7.4)中で1.5ヶ月齢ラット脳をホモジナイズ後、遠沈法で粗膜成分を調製。5mgの粗膜成分に0.5%のCHAPSを含む1mlのbuffer Aを添加4℃で90min攪拌、受容体成分の可溶化を試みた。可溶化膜成分200μgを用いRRAを実施すると、明らかに非標識リガンドで置換される^<125>I-HCNPの特異的結合が認められた。RRAに於ける非結合標識リガンドは30%の氷冷PEG6000を用い遠沈法で除去した。
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