1999 Fiscal Year Annual Research Report
新規神経ペプチド(HCNP)受容体の同定と単離および構造解析
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09680769
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
小鹿 幸生 名古屋市立大学, 医学部, 助教授 (20177223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森下 学 名古屋市立大学, 医学部, 研究員
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| Keywords | 神経ペプチド / 海部由来神経刺激因子 / HCNP / 受容体 / Radiolabeled Receptor Assay / RRA / 中枢神経系 / コリン作動性神経 |
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| Research Abstract |
昨年のまでの研究で、新規神経ペプチドHippocampal Cholinergic Neurostimulating Peptide(HCNP)の受容体を同定するRadiolabeled receptor assay(RRA)法を確立し、受容体は、(1)脳組織のP2画分に含まれ、(2)大脳皮質領域に多く、(3)単数の高親和性受容体からなり、(4)HCNPのC末端近傍と結合することを報告した。しかし、本法を用いて受容体の精製を実施するには非特異的結合を少なくし、用いる標本量を少なくする必要があると考えられたので、今回これらの検討を行った。(方法)これまでと同様にラットの大脳を0.32Mショ糖溶液中でホモジナイズ後、遠沈法でP2画分を分取し、-80℃凍結・融解後、20倍容のRRA溶液(50mM Tris-acetate,pH7.4)で十分洗浄して内因性ペプチドを除去した標本を用いた。標識リガンドの作成法及びRRA法について一昨年報告した方法を基準に諸種の検討を加えた。(結果及び考察)諸種の検討の結果、Back groundの低減には(1)ヨード化リガンドの純度上昇、(2)リガンドのGF/Fフィルターへの非特異的結合の減少、(3)リガンドの非結合を容易に除去・洗浄するためにも標本量の減量などが必要であることが判明した。Bolton-Hunter法でヨード化後^<125>I-HCNPを逆相系C_<18>セプパックカラムから、より多段階のステップワイズ溶出を行いヨード化リガンドの純度を80%以上に上げた(ラジオイムノアッセイ法にて検定)。また、GF/Fフィルターを各種の蛋白でブロッキングしたところ、非特異的結合は0.3%免疫グロブリン使用が最も少ないことが判明した。これらの条件でRRAを実施することによりP2画分の蛋白量を従来の200μg/assayから10μg/assayまで減量することに成功し、洗浄も容易に行えることが判明した。本法を用いこれまでの実験を再検討したところ類似した結果を得た。
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