脊髄後角のエンケファリン含有ニューロンの同定とその生理学的特徴の検討

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09680818
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 堀 雄一 獨協医科大学, 医学部, 教授 (60190229)
• Keywords: 脊髄後角表層 / エンケファリン / 逆転写反応 / ポリメラーゼ連鎖反応 / パッチクランプ法

Research Abstract

ラットを用い、脊髄後角表層の組織からRNAを抽出し、PhotometryによってRNA溶液の濃度を測定した。抽出したRNA溶液の希釈列を作り、逆転写(RT)反応によってcDNAを合成した。遺伝子増幅(PCR)法によって増幅した後、アガロースゲル電気泳動によってcDNAを検出した。RNA溶液の希釈列の検討によって、一つのニューロンに含まれると考えられる1pg以下のオーダーのmRNAから、エンケファリン(Enk)のmRNAを検出できることを確認した。また、全てのニューロンに普遍的に発現していると考えられる代謝酵素であるG3-PDHのプライマーを作成した。これらのmRNAも十分な感度で検出することができた。
次に、脊髄後角ニューロンを単離し培養した。この培養維持したニューロンから、形態などから後角表層ニューロンと考えられるニューロンを選択しパッチクランプ・ホールセル記録を行なった。その後、そのニューロンから細胞質を採取し、RT-PCR法によってEnk、G3-PDHのmRNAの同定を試みた。ほぼ全例でG3-PDHのmRNAが検出された。また、約8%のニューロンにEnkのmRNAが検出された。このEnk含有ニューロンの膜容量、膜抵抗およびK電流の性質を検討したが、Enk非含有ニューロンと比べて特異な差異は現在のところ見いだされなかった。
今後、さらに、Enkのプライマーの設計に改良を加えて、感度の増強を試み、パッチクランプ・単一細胞RT-PCR法によるEnk含有ニューロン同定方法の確立を目指したい。

Research Products

• [Publications] Shigeki Yamaguchi: "Extracellular sodium concentration has diverse effects on the hypoxia-induced increase in intra-cellular Ca^<2+> in rat hippocampal slices." Neuroscience Letters. 232・2. 163-166 (1997)
• [Publications] Shinpei Hanazawa: "Enhancement of formalin-induced licking response in mutant mice lacking D-amino-acid oxidase." Pain Research. 12・3. 151-151 (1997)