出芽酵母の核に局在する新規アクチンファミリーのタンパク質分子相互作用の解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09760066
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 原田 昌彦 東北大学, 農学部, 助手 (70218642)
• Keywords: 出芽酵母 / 核タンパク質 / アクチン関連タンパク質 / アクチンファミリー / クロマチン / ヒストン / タンパク質間相互作用 / ヌクレオソーム

Research Abstract

Act3pは酵母の生育に必要なタンパク質であり、そのアミノ酸配列のほぼ全域で他のアクチンファミリーに相同性を示すが、2カ所に他のアクチンファミリーには存在しない挿入ペプチド領域が存在する。Far-western-blot法により、この領域が3種類のDNA結合能をもつ核タンパク質と相互作用していることが示された。このことから、Act3p特異的領域はこれらのタンパク質を介して間接的にDNAと相互作用をしていると考えられつ。本研究では、Act3と相互作用する3種のDNA結合タンパク質の同定、およびその相互作用の解析、Act3pとこれらのタンパク質の相互作用がクロマチン構造に与える影響の解析などについて、解析を行った。
Act3p特異的領域と結合するタンパク質をDNA-celluloseカラムとイオン交換カラム等を組み合わせることで部分精製した。この画分をSDS-PAGEの後ニトロセルロース膜に移行させ、目的のバンドを切り取った後、膜上でタンパク質を酵素消化し、回収したペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、このうちの一つがヒストンH3であることが示された。また、精製した4種のヒストンを用いてfar-western-blot法を行ったところ、Act3pがこれらのヒストン全部に結合する能力があることが示された。
ACT3特異的領域をGal4のDNA結合領域をコードするベクターに組み込み、出芽酵母の4種のヒストンの遺伝子のそれぞれをGAL4の転写活性化領域をコードするベクターに組み、これらを用いてTwo-bybrid法を行った。その結果、Act3p特異的領域がこれらのヒストンと結合する能力があることが示された。

Research Products

• [Publications] Kenji Shimada, et al.: "A nuclear matrix-associated high molecular weight nuclear antigen, HMNA, of chicken and marked decrease of its immunoreactivity during the progression of S-phase" Journal of Cell Science. 110. 3031-3041 (1997)
• [Publications] Viktoria Weber et al.: "Purification and nucleic-acid binding properties of a Saccharomyces cerevisiae protein involved in the control of ploidy" European Journal of Biochemistry. 249. 309-317 (1997)