1997 Fiscal Year Annual Research Report
クロコウジカビ酸性プロテアーゼAの高分解能X線結晶構造解析
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09760071
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
佐々木 宏 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助手 (80272467)
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| Keywords | 蛋白質結晶構造解析 / 酸性プロテアーゼ / Aspergillus niger / ペプチドライブラリー |
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| Research Abstract |
1.4A分解能で決定された酸性プロテアーゼAの立体構造をもとに以下のような解析を行った。
1)本酵素の立体構造は、2枚のβシートが平行に重なりあうことによって構築されており、ペプシン型酸性プロテアーゼとは全く異なる2次構造モチーフを持っている。そこで、プログラムDALIを用いて、Protein Data Bank に登録されているタンパク質の中で類縁の立体構造を持つものを検索した。その結果、本酵素は全く新規のトポロジーを持つタンパク質であることが明らかとなった。
2)ペプシン型酸性プロテアーゼの触媒部位では2個のAspと加水分解反応に必要な水分子がお互いに水素結合を形成していることが知られている。しかし、本酵素ではこのような側鎖の配置は見出されなかった。そのため、本酵素は、ペプシン型酸性プロテアーゼの特異的阻害剤のDAN,EPNPと反応しないものと考えられる。
3)本酵素の触媒部位を推定するために、プログラムGRASPを用いて静電ポテンシャル計算を行い、ペプシン型酸性プロテアーゼとの比較を行った。ペプシン型酵素では、触媒残基部分の分子表面に負の静電ポテンシャルが見出されたが、本酵素でも同様に分子の内側のくぼみ部分に負の静電ポテンシャルが存在し、およその触媒部位の位置を推定することができた。
ペプチドライブラリ法による本酵素の基質特異性の網羅的探索により、以下のことが明らかとなった。
4)P1部位について、pH2.0付近の強酸性条件下では、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジンに対して特異性を有することが、すでに明らかとなっていた。ところが、pH5.0ではヒスチジンのみに非常に高い特異性を示すことがわかった。
5)P2部位について、塩基性アミノ酸残基に対して特異性が高いことがわかった。このような高い基質特異性は、本酵素が菌体外にて情報伝達、プロセシングなどの何らかの生理的役割を担うことを示唆するものと思われる。
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