放線菌の生産するテルペノイドの生合成遺伝子のクローニングと解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09760114
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 葛山 智久 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (30280952)
• Keywords: biosynthesis / terpenoid / Streptomyces / mevalonate / HMG-CoA reductase

Research Abstract

目的:テルペン化合物の普遍的生合成経路として、メバロン酸経路が知られているが、微生物起源のメバロン酸経路の酵素や遺伝子に関する研究は、3種の古細菌に関して報告されているものの、真正細菌においては全く報告がない。そこで、メバロン酸経路で生合成されることが判明しているnaphterpinの生産菌Streptomyces sp.から、メバロン酸経路の律速段階であるhydroxymethylglutaryl-CoA(HMG-CoA)還元酵素(EC1.1.1.34)を精製し、その諸性質の解析を行った。
2.方法と結果:菌体を超音波破砕し、硫安処理、熱処理を含め、DEAE-Sephacel、Butyl Toyopearl、Blue Sepharose、MonoQ、CoA affinityの各カラムクロマトグラフィーにより約3000倍に精製した。分子量は、ゲル濾過及びグラジエントゲル電気泳動では120kDa、SDS-PAGEでは41kDaであり3量体として機能することが推定された。サブユニットの分子量はこれまでに報告されている古細菌のHMG-CoA還元酵素よりも約8kDa小さいものであった。基質に対するKm値は、それぞれ62uM(NADPH):7.7uM(HMG-CoA)であった。また、HMG-CoA還元酵素に特異的な阻害剤であるプラバスタチンに対するKi値は5.5nMであった。各種の緩衝液を用いて酵素活性を測定した結果、至適pHは7.2であった。本酵素は高い熱安定性を示し、70°C、10分間の熱処理によっても約50%の活性が確認された。これらの酵素化学的性質は、真核生物や古細菌で報告されているものと類似していた。