消化管粘膜細胞の遊走・増殖・分化、癌化機構における増殖因子及びCOXS2の役割

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09770383
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 清水 秀剛 順天堂大学, 医学部, 助手 (80235663)
• Keywords: cyclooxygenase2 / transfection / 胃粘膜損傷修復 / sense / antisense

Research Abstract

平成9年度の計画として
胃粘膜損傷修復過程におけるCOX2の役割を調べる為に、Cyclooxygenase2(COX2)を過剰発現させた細胞(sense cell)及び発現しない細胞(anti-sense cell)を作成し、損傷修復モデルによるこれら遺伝子の損傷修復に及ぼす影響を調べる事とした。まずsense cell及びanti-sense cellの作成を試みた。大腸癌からC-DNA libraryを作成。(Stratagene)PCRにて276bpのCOX2遺伝子を増幅、このPCR productsをplasmidにsubcloning。(TA cloning kit by lnvitrogen)このFragmentをprobeとして、plaque hybridyzationでC-DNAをScreeningし、完全長のCOX2 C-DNAを含むcloneをpick upした。このcloneから、open reading frameを制限酵素(EcoR I Ssp I)で切り出し、更にKlnow fragmentによりblunt endとし、mammalian expression Vector(PCB7)へsense antisense方向に組み込んだ。作成したVectorが働くか否かをCOX2を発現しないHCT116 cellにtransientにtransfectionし、RNA、Proteinのレベルからこれらの発現をみた。叉、LacZ産生plasmidをtransfectionの効率を調べる意味で、transient transfectionした。Lipofectine法によるtransfectionの効率は、約20%であり、Human COX2の遺伝子をsense方向にくみ込んだplasmidは、目的とする2,0kbのRNA及びkdの蛋白質を発現した。一方antisense方向に組み込んだplasmidは、目的とする長さのRNAは発現しなかった。(約0.2kb)これらのplasmidを通常状態ではCOX2を発現しない小腸上皮のcell lineであるRIE cellと胃粘膜上皮のcell lineであるGSM06 cellと大腸癌のcell lineのHCT116にそれぞれstable transfectionする事とした。transfectionの後のcolony selectionは、Hygromycine Bにて施行8週間の後にcloneの解析を行ったが、false negativeが多く約300cloneをpick upしわずかに1 cloneでCOX2 positive cloneが認められた。今後はこれらのcloneを使用して研究計画に述べたような更なる解析が必要と思われる。