1997 Fiscal Year Annual Research Report
DRPLAおよびMJD蛋白の大量精製と生化学的解析
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09770438
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
中村 浩一郎 東京大学, 医学部・附属病院, 教務職員 (40282644)
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| Keywords | バキュロウイルス / DRPLA / MJD(Machado-Joseph Disease) / Histidine-Tag / ポリグルタミン / イオン交換クロマトグラフィーカラム / 疎水性クロマトグラフィーカラム / キレ-テイングクロマトグラフィーカラム |
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| Research Abstract |
1.組換え蛋白発現バキュロウィルスの構築
全長のDRPLAおよびMJD遺伝子をバキュロウィルス用のトランスファーベクターpBlueBacHisに組込んだ。このトランスファーベクターを野生型バキュロウィルスDNAと共に昆虫細胞(Sf9)にco-transfectionすることにより相同組換えにより当該蛋白の発現バキュロウィルスを構築した。DRPLAおよびMJD遺伝子のN末に組込んだHis-Tagに対する抗体を用いて発現組換え蛋白をウェスタンブロットにて確認した。
2.組換えDRPLAおよびMJD蛋白の大量精製
組換えDRPLAおよびMJD蛋白を大量精製するため、最初にスモ-ルスケールで精製条件の検討を行った。現在まで、イオン交換カラム(DEAEおよびMonoQ)、疎水性カラム(Buty1-Sepharose4)、キレ-ティングカラム(Ni-Resin)等を用い、それぞれのカラムでの吸着条件を決定した。現在、MJD蛋白に関しては、抗MJD抗体カラムを作成し、吸着条件を決定中である。
ポリグルタミン近傍を認識する抗体の作成
DRPLA蛋白のポリグルタミン近傍のcDNAをpETベクターT7プロモーターに組込み大腸菌にて組換え蛋白を作成した。Ni-Resinカラムにて粗精製の後、preparative SDS-PAGEにて分子量分取により目的の蛋白を精製した。ウサギに免疫し、ポリクローナル抗体を作成中である。
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