血管平滑筋細胞増殖における低分子量G蛋白質RhoAによるPLD活性化

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09770520
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 甲斐 久史 久留米大学, 医学部, 助手 (60281531)
• Keywords: ホスホリパーゼC / ホスホリパーゼD / RhoA / 低分子量G蛋白質 / 細胞増殖

Research Abstract

(1)ラット血管平滑筋細胞の培養法の確立:
雄性Wistar-Kyoto系ラットより無菌的に胸部大動脈を摘出し、酵素分散法により中膜血管平滑筋細胞(VSMC)を初代培養した。これを継代培養し以下の実験に供した。
(2)培養VSMCにおけるホスホリパーゼC(PLC)活性・ホスホリパーゼD(PLD)活性の測定系の確立:
^3[H]イノシトールでラベルしたVSMCに、アンジオテンシンIIあるいは過酸化バナジン酸で刺激を加えた後の^3[H]イノシトール三リン酸産生をイオン交換樹脂クロマトグラフィー法を用いて測定し、VSMCにおけるPLC活性の指標とする系を確立した。またアンジオテンシンIIあるいは過酸化バナジン酸によるPLD活性化能を、^3[H]パルミチン酸でラベルしたVSMCの^3[H]フォスファチジルブタノール産生を薄層クロマトグラフィー法を用いて測定する系を確立した。
(3)培養VSMCの各種刺激時の細胞増殖・細胞肥大の検討:
10%血清・アンジオテンシンII・過酸化バナジン酸刺激時の^3[H]チミジン・^3[H]ロイシン取り込み能を測定し、VSMCの増殖・肥大をそれぞれ検討する系を確立した。
(4)RhoAアンチセンス組み換えアデノウイルスの作成:マウスRhoAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(as-ODN)・センスオリゴヌクレオチド(s-ODN)およびas-ODNのスクランブルオリゴヌクレオチド(scr-ODN)を各3組作成した。現在、サイトメガロウイルスエンハンサーとβアクチンプロモーターからなるCAプロモーターを持つアデノウイルスベクターpAdexCA1wに、RhoAに対するas-ODN・s-ODN・scr-ODNを組み換えたアデノウイルスを作成中である。