1997 Fiscal Year Annual Research Report
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09771051
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
本望 修 札幌医科大学, 医学部, 助手 (90285007)
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| Keywords | gene therapy / epilepsy / GABA / GAD / transporter |
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| Research Abstract |
GABA合成酵素であるglutamic acid decarboxylase(GAD)のhuman cDNA(EcoR1処理済み)をCIAP処理済みのpCl-neo expression vector(EcoR1処理済み)へligationし、heatshock法にてJM119にtransfectionした後、LB/Amp plateに播種、37度にて培養した。得られたcolonyをT7,T3 primerによるPCR productを解析し、insertと向きの確認を行った。GAD cDNAの組み込みを確認されたクローンはLB/Ampで培養後、plasmid抽出によりDNA(pCl-neo-GAD)を得た。
精製したDNA(pCl-neo-GAD)をlipofection方法にてhuman astrocyteへ導入した。遺伝子導入された細胞の選別はdrug selection(G418)にて行ない、また、GAD cDNAの導入、発現はimmunocytochemistoryで確認した。また、細胞内GABAの存在をimmunocytochemistoryで確認した。
現在はGAD mRNAの発現をin situ hybridizationで確認中であり、Western blotによる蛋白定量を施行予定である。また、同時にHigh Pressure Liquid Chromatography(HPLC)での細胞内GABA濃度の測定とwhole cell voltage clampによるGABA currentの測定により、GAD遺伝子導入細胞のGABA含有量とGABA放出能の測定を行なっている。
以上のように、補助金は補助条件に従って非常に有効に使用されている。
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