ストレプトコッカスミュータンス酸ストレス蛋白質の遺伝子クローニング

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09771521
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 助手 (80246917)
• Keywords: Streptococus mutans / cDNA / サブトラクション

Research Abstract

S.mutans GS5をSucrose存在下および非存在下の培地中で嫌気下培養した後、total RNAを分離した。これには、菌体破壊が容易でないミ-タンスから短時間で質の良いものを得るために、FastPrep Machine(Bio101)を用いることを検討した。得られたtotal RNAをテンプレートとしてRandom primer(N)_6を用いてcDNA合成を行った。このサンプルをSpun Column(Pharmacia)を通すことにより、tRNA由来のcDNAを取り除いた。rRNAsの除去を試みるにあたり、大腸菌の16S,23S rRNAの塩基配列を参考にプライマーを作成し、S.mutans染色体DNAをテンプレートとして、ビチオンでラベルしたPCR産物を作成した。調製した誘導群および非誘導群cDNA、ビオチンラベルの16S,23S rRNAコード断片を加えてサブトラクションを3回行った。各サブトラクション後、ストレプトアビジンを加え、フェノール・クロロフォルム処理によりビオチンラベルの断片にハイブリッドしたcDNA断片を除去した。これを致死遺伝子ccdB中に産物挿入部位を有するZeroBlant PCR Cloning Kit(Invitrogen)を用いるクローニングし、スクリーニング後、DNA sequencingにより、塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行った。その結果、ATPase遺伝子に非常に高いホモロジーを持つものが得られた。しかしながら、得られた他の塩基配列は16S,23S rRNA遺伝子であるものが多く、改善法として、現在、ストレプトアビジンがコートされてる磁気ビーズを使用し、さらにrRNAPCR断片をより分離することにより、トラップ効率を上げることを試みている。