Prevotella intermediaのエラスターゼ遺伝子のクローニング

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09771526
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 柴田 幸永 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (10170903)
• Keywords: P.intermedia / エラスターゼ / クローニング

Research Abstract

エラスターゼを産生するP.intermedia EL-2-1の染色体DNAを抽出・精製し,EcoRIを作用させた。得られたDNA断片をpUC19のEcoRI部位に組み込み,これら組み替えプラスミドで大腸菌JM109を形質転換した。このプラスミドライブラリーからのエラスターゼ遺伝子のスクリーニングは,まずカゼイン分解活性を示す形質転換体を選び,つづいて,それらからエラスチン分解活性を有する形質転換体を得るという方法で行った。すなわち,形質転換した大腸菌をスキムミルク,アンピシリンを含むLBプレートにまき,コロニー周囲の透明帯の発現によってカゼイン分解活性の有無を調べた。約10,000のコロニーから2株の陽性クローンを得ることが出来た。さらにこれら2株をエラスチン粉末(ウシ靱帯,20mg/ml),アンピシリンを含むLBプレートに植えた。1株がエラスチン分解活性を示した。さらに,この菌体を6Mグアニジン塩酸で処理するとエラスターゼの合成基質Glt-Ala-Ala-Pro-Leu pNAに分解活性を示すようになった。P.intermediaエラスターゼの精製にあたり,酵素活性の測定にはGlt-Ala-Ala-Pro-Leu pNAを基質としたこと,出発材料は膜画分からの6Mグアニジン塩酸抽出物であることを考えると,目的とする遺伝子がクローニングされたと推定した。このクローンがもつプラスミドには約6kbの外来DNAが挿入されていた。このDNAの制限酵素地図を作製し,目的遺伝子はPstI-XbaI3.1kb上に存在することが判明した。現在この領域の塩基配列を決定中である。