唾液腺におけるcGIPDEのクローニング

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09771566
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 村田 琢 三重大学, 医学部・附属病院, 助手 (80242965)
• Keywords: phosphodiesterase / cAMP / cGIPDE

Research Abstract

cGMP-inhibitd cyclic nucleotide phosphodiesterase(cGIPDE)は、細胞内のcAMP濃度を調節することにより、心筋の収縮や脂肪細胞の脂肪代謝などに関係しているが、唾液腺のcGIPDEについての研究はほとんど行われていない。これまでにわれわれはinsitu hybridization法によりラット唾液腺でcGIPDEが大量に発現していることを見いだし、また、唾液腺由来細胞と唾液腺にcGIPDE活性を認めた。以上のことより唾液腺においてcGIPDEは非常に重要な役割がある可能性が示唆されたため、ラット唾液腺のcGIPDEのクローニング計画した。
ラット顎下腺よりtotalRNAを調整し、逆転写酵素にてcDNAを合成後、additional region を含む catalytic domainをprimerとしてPCRを行い、予想どうりの約350bpのバンドを得た。 PCR産物のシークエンスよりcGIPDEであることを確認した。PCR産物を精製後、スクリーニングのprobeとして使用する予定である。cDNAライブラリーの作成のためラット顎下腺のtotalRNAからmRNAを精製した。オリゴdTをプライマーとしてcDNA合成を行い、EcoRIアダプターの連結後、cDNAをベクターに挿入し、パッケージング反応後、力価測定を行い、cDNAライブラリーとして使用する。ラット唾液腺のcGIPDEをクローニング後、バキュロウイルスにて発現させるために、これまでにクローニングしたcGIPDEのcDNAを発現ベクターのpVL1393バキュロウイルストランスファーベクターに挿入し、バキュロウイルスと共にSf9昆虫細胞に感染させ、ウエスタンブロッティングとcGIPDE活性の測定などを行いcGIPDEの発現に使用できることを確認した。
ラット唾液腺のcGIPDEをクローニング後、リコミナントプロテインを発現させこれまでの研究結果と詳細に比較検討する予定である。