1998 Fiscal Year Annual Research Report
増殖細胞核抗原(PCNA)が関与するDNA修復の分子機構の解析
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09771959
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
森岡 弘志 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (20230097)
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| Keywords | 増殖細胞核抗原 / PCNA / DNA修復 / FEN-1 / 部位特異的変異 |
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| Research Abstract |
PCNAは,真核細胞のDNA複製に関与するDNAポリメラーゼδ(polδ)のprocessive DNA合成に必須の補助因子であり,複製因子C(RFC)のDNA依存性ATPase活性を促進することが知られている.また,紫外線照射により損傷を受けたプラスミドを鋳型とした無細胞ヌクレオチド除去修復系による実験から,ヌクレオチド除去修復因子の1つとしても示唆されている.さらに,サイクリン依存性キナーゼの阻害因子であるp21やGADD45,DNA複製および修復の両方に関与するFEN-1等に結合することが報告される等,PCNAはDNA上で起こる各種反応の制御機構に重要な役割を果たしていると考えられている.本研究の代表者は,PCNAが関与するDNA修復の分子機構の解明を目的として,組換え型ヒトPCNA変換体を用いて,特にFEN-1との相互作用の解析を行っている.以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.
PCNAの21番目のアスパラギン酸をアラニンに変換した変異体ではRF-cの.ATPase活性促進およびPolδのDNA鎖伸長反応促進は野生型PCNAと同様であったがFEN-1のエンドヌクレアーゼ活性促進は野生型PCNAに対し20〜40%まで低下していた.そこで,21番目のアスパラギン酸をグルタミン酸(D21E)またはアスパラギン(D21N)に変換した変異体を作製し,FEN-1のエンドヌクレアーゼ活性促進能を調べたところ,D21Eでは野生型と同等の活性促進能を示したが,D21Nでは野生型の10〜30%しか活性促進能がみられなかった.以上のことから,FEN-1のエンドヌクレアー活性促進にはPCNAの21番目のアスパラギン酸の負電荷が重要と考えられた.
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[Publications] Morioka,H.: "Antibodies specific for (6-4) DNA photoproducts: Cloning,antibody modeling and construction of a single-chain Fv derivative." Biochim.Biophys.Acta. 1385. 17-32 (1998)
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[Publications] Torizawa,T.: "^<31>P NMR study of the interactions between oligodeoxynucleotides containing (6-4) photoproduct and Fab fragments of monoclonal antibodies specific for (6-4) photoproduct." FEBS Lett.429. 157-161 (1998)
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[Publications] Oku,T.: "Functional sites of human PCNA which interact with p21(Cip1/Wafl),DNA polymerase d and replication factor C." Genes to Cells. 3. 357-369 (1998)
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[Publications] Kobayashi,H.: "The role of surface lysines in pyrimidine(6-4)pyrimidone photoproduct binding by a high-affinity antibody." Protein Eng.11. 1089-1092 (1998)
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[Publications] Kobayashi,H.: "Probing the Interaction between a high-affinity single-chain Fv and pyrimidine (6-4) pyrimidone photodimer by site-directed mutagenesis." Biochemistry. 38. 532-539 (1999)
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[Publications] Kobayashi,H.: "Effects of a high-affinty antibody fragment on DNA polymerase reactions near a(6-4)photoproduct site." Photochem.Photobiol.69. 226-230 (1999)
