cyclic ADP-ribose合成・分解酵素の基質と調節因子の結合部位の決定

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09780559
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 東郷 暁 東北大学, 医学部, 助手 (40282123)
• Keywords: cyclic ADP-ribose / second messenger / CD38 / ADP-ribosyl cyclase / cyclic ADP-ribose hydrolase

Research Abstract

cyclic ADP-ribose (cADPR)は申請者らがインスリン分泌のセカンドメッセンジャーとして新しく見出した細胞内情報伝達物質である。申請者らはまた、cADPRの合成・分解酵素の実体はCD38であり、CD38のcADPR分解酵素活性はATPによって抑制されることを明らかにしている。従って、cADPR合成・分解の調節機構を分子レベルで理解するためには、cADPR合成・分解酵素の基質(NAD、cADPR)と調節因子(ATP)の結合部位を同定することが重要であると考えられる。平成9年度の研究は当初計画どおり進行し、以下のような成果が得られた。
1.申請者らがすでに単離しているヒトCD38 cDNAを、C末端にエンドペプチダーゼの認識配列を有するマルトース結合蛋白質をコードするDNAの3′下流に結合した発現ベクターを構築した。
2. 1.の発現ベクターを大腸菌に導入し、CD38をマルトース結合蛋白質との融合蛋白質(MBP-CD38融合蛋白質)として発現させた後、菌内のMBP-CD38融合蛋白質をアミロースレジンカラムを用いて精製した。
3. MBP-CD38融合蛋白質をエンドペプチダーゼでMBPとCD38に切断した後、ゲル濾過法を用いてヒトCD38を精製した。精製CD38はcADPR合成・分解の両活性を有していた。
4.ヒトCD38を用いて酵素学的な検討を行なったところ、ATPはcADPR分解活性をcADPRに対して競合的に阻害した。
5.精製CD38をATPに共通するadenosine部分の類似体である5′-p-fluorosulfonylbenzoyladenosine (FSBA)とインキュベーションして標識した後エンドペプチダーゼで消化し、得られたペプチド断片をFPLC法により分離・精製した。
6. FSBAに対する抗体を用いたウェスタン・ブロット法により、分離・精製したペプチド断片のなかからFSBAで標識されたペプチド断片を同定した。

Research Products

• [Publications] Akira Tohgo: "Lysine 129 of CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase) participates in the binding of ATP to inhibit the cyclic ADP-ribose hydrolase." Journal of Biological Chemistry. 272・7. 3879-3882 (1997)
• [Publications] Shin Takasawa: "Cyclic ADP-ribose and inositol 1, 4, 5-trisphosphate as alternate second messengers for intracellular Ca^<2+> mobilization in normal and diabetic β-cells." Journal of Biological Chemistry. 273・5. 2497-2500 (1998)
• [Publications] Naoya Noguchi: "Cyclic ADP-ribose binds to FK506-binding protein 12.6 to release Ca^<2+> from islet microsomes." Journal of Biological Chemistry. 272・6. 3133-3136 (1997)
• [Publications] Koji Nata: "Human gene encoding CD38 (ADP-ribosyl cyaclase/cyclic ADP-ribose hydrolase) : organization, nucleotide-sequences and altarnetive splicing." Gene. 186・2. 285-292 (1997)
• [Publications] Hiroshi Okamoto: "Synthesis and hydrolysis of cyclic ADP-ribose by human leukocyte antigen CD38 : Inhibition of hydrolysis by ATP and the physiological significance." Methods in Enzymology. 280. 306-318 (1997)
• [Publications] Hiroshi Okamoto: "Identification of cyclic ADP-ribose-binding protein in ryanodine receptor of islet microsomes" Diabetes. 46・suppl. 1. 214A-214A (1997)
• [Publications] Hiroshi Okamoto: "Autoantibodies against CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase) in diabetic patients" Diabetologia. 40・suppl. 1. A108-A108 (1997)
• [Publications] 東郷 暁: "ATPによる膵β細胞内cyclic ADP-ribose生成の調節機構の解明" 糖尿病. 40・suppl. 1. 211-211 (1997)
• [Publications] 野口直哉: "膵β細胞のcyclic ADP-ribose感受性Ca^<2+>チャンネルからのCa^<2+>放出機構:FK506結合タンパク質の関与" 糖尿病. 40・suppl. 1. 211-211 (1997)
• [Publications] 八木一夫: "NIDDMにおけるCD38遺伝子異常の検索と変異Arg140Trp-CD38の検討" 糖尿病. 40・suppl. 1. 638-638 (1997)
• [Publications] 東郷 暁: "CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase)のATPによる活性調節機構の解明" 生化学. 69・7. 638-638 (1997)
• [Publications] 野口直哉: "FK506結合蛋白質12.6を介するcyclic ADP-ribose感受性Ca^<2+>チャンネルからのCa^<2+>放出" 生化学. 69・7. 638-638 (1997)
• [Publications] 東郷 暁: "ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase (CD38)のATPによる調節とその分子構構" 生化学. 69・11. 1319-1319 (1997)
• [Publications] 野口直哉: "FK506結合蛋白質のcyclic ADP-ribose結合活性とその生理的意義" 生化学. 69・11. 1319-1319 (1997)
• [Publications] 黒木実智雄: "膵ランゲルハンス島のリアノジン受容体型Ca2^+チャンネルcDNAの単離と構造決定" 糖尿病. 41 (in press). (1998)
• [Publications] 中沢哲也: "cyclic ADP-ribose結合蛋白質(FK506-binding protein)遺伝子の構造と染色体座位" 糖尿病. 41 (in press). (1998)
• [Publications] 加藤一郎: "CD38ノックアウトマウスの作製と膵β細胞のグルコース刺激インスリン分泌の低下" 糖尿病. 41 (in press). (1998)