細胞骨格系の滑り運動による細胞膜タンパク質の輸送機構の研究

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09780595
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 佐甲 靖志 大阪大学, 医学部, 助教授 (20215700)
• Keywords: 細胞膜 / 藤蛋白質 / 膜骨格 / 蛋白質輸送 / 一粒子追跡法 / 細胞運動 / 蛍光褪色回復法

Research Abstract

「細胞骨格系のアクチン線維と結合した細胞膜の膜貫通型蛋白質が、アクチン線維間の滑り運動によって細胞膜上を輸送されている」という仮説を検証することが本研究の目的である。そのために、前年度に開発した2光子励起蛍光顕微鏡を用いた光褪色法を用いて、膜骨格系のアクチンフィラメントの運動を測定し、膜タンパク質の運動との相関を求めることを計画した。
本年度は、前年に名古屋大学から大阪大学へ移動したため、新たに、大阪大学において2光子励起蛍光顕微鏡の立ち上げをおこなった。極超短パルスのTiサファイアレーザーを光源とし、市販の共焦点顕微鏡スキャナーを改造して倒立顕微鏡に接続し、2光子励起蛍光顕微鏡とした。この装置が以前に使用していた装置と、空間分解能、S/N等において同程度の性能を持つことを確かめた。
細胞内のアクチン線維を蛍光標識するために、化学標識したアクチンモノマーを顕微注入する予定であったが、より効率よく、細胞に対するダメージもなく実験をおこなうため、GFP融合アクチン遺伝子を培養細胞に発現させることとし、クローニングによってGFP-アクチンを安定に発現する細胞株を得ることができた。
この細胞を2光子励起蛍光顕微鏡で観察し、ドーサル面の細胞膜直下約1μm程度の厚さの断層像で、膜骨格系と思われるアクチン線維のネットワークを見ることができた。
このように、光褪色法でアクチン線維の動きを測定する準備が整ったので、今後は当初の計画通り実験を進めていく。

Research Products

• [Publications] Sako,Y.et al.: "Cytoplasmic regulation of the movement of E-cadherin on the free cell surface as studied by optical tweezers and single particle tracking:corraling and tethering by the membrane skeleton." J.Cell Biol. 140. 1227-1240 (1998)
• [Publications] Takeuch,M.,Sako,Y.et al.: "Structure of the erythrocyte membrane skeleton as observed by atmic force microscopy" Biophys.J.74. 2171-2183 (1998)
• [Publications] Tomishige,M.,Sako,Y.and Kusumi,A.: "Hop deffusion of band3 across the membrane skeleton barriers in the eryghrocyte membrane." J.Cen Biol.142. 989-1000 (1998)